摘要：采用高產(chǎn)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）SCY6發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙醇，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)考察該酵母菌株適宜的生長條件，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的條件。結(jié)果表明，該酵母菌株的最適生長溫度和pH分別為28 ℃、5.0，培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時其生長狀態(tài)較好。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，最適合該釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的條件為玉米漿和（NH4）2SO4作為氮源，用量分別為20 g/L和2 g/L，接種量為4%，pH 5.0。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)可達(dá)7.77%，葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)83.82%。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；生長；發(fā)酵；乙醇

中圖分類號：TS261.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4856-04

Optimization of Growth and Fermentation Conditions for High Ethanol-Producing Saccharomyces cerevisiae Strain SCY6

GU Hua-xiang，SONG Chen，LI Xun

（College of Chemical Engineering， Nanjing Forestry University/Jiangsu Key Lab of Biomass-Based Green Fuels and Chemicals，

Nanjing 210037， China）

Abstract： The high ethanol-producing Saccharomyces cerevisiae strain SCY6 was used to ferment glucose to ethanol. Single factor tests were conducted to optimize the cultivation conditions； while orthogonal design was adopted to optimize ethanol fermentation conditions. The results showed that the optimum temperature and pH for yeast growth was 28 ℃ and 5.0， respectively. The yeast grew well when mass ratio of glucose in YPD medium was 15%. The result of orthogonal test showed that the optimal ethanol fermentation conditions were， 2 g/L（NH4）2SO4 and 20 g/L corn syrup as N source； inoculation dose， 4% volume fraction； and pH 5.0. The yield of ethanol reached 7.77%； and the conversion rate of glucose was 83.82% under these conditions.

Key words： Saccharomyces cerevisiae； growth； fermentation； alcohol

隨著科技的不斷發(fā)展，人們對燃料型能源的需求日益加大。石油煤炭資源不僅污染環(huán)境，而且是不可再生資源。乙醇作為石油的替代能源，具有污染小、可再生、易運(yùn)輸和易儲藏的特點(diǎn)，將農(nóng)林廢棄物轉(zhuǎn)化為燃料乙醇是解決能源危機(jī)的一條理想途徑[1，2]。燃料乙醇的生產(chǎn)分為化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化兩種方式，其中生物轉(zhuǎn)化法以其低污染和高效率的特點(diǎn)更具競爭力。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是生物轉(zhuǎn)化法發(fā)酵產(chǎn)乙醇最常用的菌種之一，目前對釀酒酵母發(fā)酵工藝的改進(jìn)已成為研究的熱點(diǎn)[2-4]。本研究對一株高產(chǎn)釀酒酵母的生長與發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為實(shí)現(xiàn)乙醇的低成本、高效率生產(chǎn)，促進(jìn)酵母在乙醇發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)用菌種為江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選的一株高產(chǎn)釀酒酵母SCY6。

主要儀器包括超凈工作臺（AIRTECH）、生物分光光度計(jì)（Eppendorf）、ZHWY-2102C系列振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）、WFZ UV-200型紫外分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司）、SBA-40E生物傳感分析儀（山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）等。

1.2 方法

1.2.1 釀酒酵母生長條件的優(yōu)化 ①釀酒酵母生長曲線的繪制。以5%的接種量（體積分?jǐn)?shù)，下同）將釀酒酵母菌株接入50 mL YPD液體培養(yǎng)基中（pH 5.0），在28 ℃培養(yǎng)，每隔5 h取樣測OD600 nm，至OD600 nm變化趨緩為止，根據(jù)酵母濃度（血球計(jì)數(shù)法）和OD600 nm繪制酵母的生長曲線[5，6]。②培養(yǎng)溫度。以5%的接種量接入對數(shù)生長期的酵母種子液至50 mL YPD液體培養(yǎng)基中（pH 5.0），分別在24、26、28、30 ℃振蕩培養(yǎng)20 h后測定菌液OD600 nm，確定酵母生長的最適溫度。③pH。以5%的接種量接入對數(shù)生長期的酵母種子液于50 mL YPD液體培養(yǎng)基中，調(diào)菌液pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)20 h后測定菌液OD600 nm，確定酵母生長的最適pH。④葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)[7]。分別在50 mL YPD液體培養(yǎng)基（pH 5.0）中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%、15%、20%、25%、30%、35%的葡萄糖，在28 ℃振蕩培養(yǎng)20 h后測定菌液的OD600 nm。

1.2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化釀酒酵母的發(fā)酵條件 ①接種量。分別按4%、6%、8%的接種量將釀酒酵母種子液接入含葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的50 mL YPD培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min的培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)，24 h后取樣測定發(fā)酵液中的乙醇含量。②pH。YPD培養(yǎng)基中添加葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，以5%的接種量接入釀酒酵母種子液，在28 ℃、150 r/min的培養(yǎng)箱中發(fā)酵培養(yǎng)，24 h后取樣測定其乙醇含量。③氮源。根據(jù)表1配制含氮源的培養(yǎng)基，其中氮源1的添加量為20 g/L，氮源2的添加量為2 g/L，并加入一定量的無機(jī)鹽，以YPK培養(yǎng)基為空白對照。采用①～③優(yōu)化后的條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，24 h后取樣測定其乙醇含量。

1.2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化釀酒酵母發(fā)酵條件 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)考察玉米漿添加量、（NH4）2SO4添加量、pH和接種量對發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響[8，9]，因素與水平見表2。

1.2.4 指標(biāo)測定 ①葡萄糖殘余量：采用生物傳感分析儀測定[10]；②乙醇含量：采用比色法測定發(fā)酵液中乙醇的體積分?jǐn)?shù)[11]；③酵母菌濃度：采用生物分光光度計(jì)測定菌液的OD600 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)釀酒酵母生長條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 釀酒酵母的生長曲線 釀酒酵母生長曲線見圖1，可以看出，釀酒酵母SCY6菌株在培養(yǎng)18 h后達(dá)到穩(wěn)定生長期，且OD600 nm和菌液濃度反映的生長情況基本一致，因此可選擇培養(yǎng)14 h的酵母作為接種出發(fā)菌種，并以O(shè)D600 nm作為后期反映釀酒酵母生長情況的指標(biāo)。

2.1.2 釀酒酵母生長的最適溫度 釀酒酵母SCY6菌株在不同溫度下的生長情況見圖2?？梢钥闯霎?dāng)溫度由24 ℃上升到28 ℃時菌液的OD600 nm逐漸升高，而溫度高于28 ℃時OD600 nm急劇下降，可能是由于高溫影響了該菌的代謝酶活性，從而抑制其生長?？梢奡CY6的最適生長溫度為28 ℃。

2.1.3 釀酒酵母生長的最適pH 從圖3可知，pH由4.0升高到5.0，菌液的OD600 nm增大，在pH 5.0時達(dá)到最大，之后隨pH的增大菌液的OD600 nm逐漸下降，可見釀酒酵母生長的最適pH為5.0。

2.1.4 葡萄糖添加量對酵母生長的影響 培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖，釀酒酵母的生長情況如圖4所示?？梢钥闯?，葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時菌株長勢最好，其OD600 nm最高。葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于15%時，菌株生長所需糖量不足，生長速度減慢；葡萄糖濃度過高，會造成酵母細(xì)胞的失水，菌株生長受到抑制。

2.2 釀酒酵母發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 接種量對釀酒酵母發(fā)酵的影響結(jié)果 按不同的接種量接入活化的酵母種子液，發(fā)酵產(chǎn)乙醇的結(jié)果見圖5?？梢钥闯觯臃N量為6%時發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)明顯高于接種量為4%和8%時。分析原因，可能是接種量為4%時酵母的生長量和酶的分泌量不夠，導(dǎo)致發(fā)酵所產(chǎn)乙醇量少；而接種量大于6%時酵母的生長量過大，代謝消耗的葡萄糖多，且老化的菌體量偏大，代謝副產(chǎn)物增多，從而導(dǎo)致發(fā)酵液中的乙醇含量偏低。

2.2.2 pH對釀酒酵母發(fā)酵的影響結(jié)果 由圖6可知，pH為5.0時發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)最高，發(fā)酵效果最好，釀酒酵母的最適發(fā)酵pH與最適生長pH一致。說明過酸或過堿環(huán)境不僅會對菌種的生長不利，同時也會抑制發(fā)酵途徑中的酶促反應(yīng)，使催化效率降低。

2.2.3 氮源對釀酒酵母發(fā)酵的影響結(jié)果 不同氮源組合對SCY6的發(fā)酵效果有顯著影響，由圖7可知，以牛蛋白胨和（NH4）2SO4作為混合氮源的培養(yǎng)基（6）中乙醇含量最高，發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)可達(dá)到7.50%，其次是玉米漿和（NH4）2SO4作為混合氮源的培養(yǎng)基（2），乙醇體積分?jǐn)?shù)為7.04%?？紤]到牛蛋白胨的價格比較貴，因此選擇價格比較低廉的玉米漿和（NH4）2SO4混合氮源培養(yǎng)基進(jìn)行乙醇發(fā)酵。

2.3 釀酒酵母發(fā)酵正交試驗(yàn)結(jié)果

采用正交試驗(yàn)對該高產(chǎn)釀酒酵母的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表3。可以看出4個因素中對發(fā)酵后菌液中乙醇體積分?jǐn)?shù)影響最大的是玉米漿含量，其次是接種量，pH和（NH4）2SO4含量的影響較小。最適的發(fā)酵條件為A2B2C2D1，即玉米漿含量20 g/L、（NH4）2SO4含量2 g/L、接種量4%、pH 5.0。在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)為7.77%，優(yōu)于正交試驗(yàn)組合，殘?zhí)橇繛?.6 g/L，此時葡萄糖轉(zhuǎn)化率為83.82%，發(fā)酵效果良好。

3 結(jié)論

影響釀酒酵母生長和乙醇發(fā)酵的因素有很多，對實(shí)驗(yàn)室篩選的一株高產(chǎn)釀酒酵母SCY6的生長條件進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)該酵母菌株的最適生長溫度和pH分別為28 ℃、5.0，培養(yǎng)基中葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時其生長狀態(tài)較好。正交試驗(yàn)結(jié)果表明最適合該釀酒酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的條件為玉米漿和（NH4）2SO4作為氮源，用量分別為20 g/L和2 g/L，接種量為4%，pH 5.0。在此條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液中乙醇體積分?jǐn)?shù)可達(dá)7.77%，葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)83.82%。

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收稿日期：2012-02-07

基金項(xiàng)目：國家林業(yè)局引進(jìn)國際先進(jìn)林業(yè)科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（2009-4-63）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

作者簡介：顧華祥（1990-），男，江蘇鹽城人，在讀本科生，（電話）13701585718（電子信箱）guhuaxiang2008@163.com；

通訊作者，李 迅（1975-），女，副教授，碩士生導(dǎo)師，（電子信箱）xunlee@163.com。