摘要：目前對克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）眼柄切除誘導卵巢成熟的分子機制還很不清楚。借鑒國外最新研究結果，探討了克氏原螯蝦單側眼柄切除后第1、7、15天體長、體重及卵巢的一系列變化情況，利用實時定量PCR技術比較分析了眼柄切除前、后卵巢組織中鈣調蛋白基因（CaM）與質膜Ca2+-ATPase基因（PMCA）的表達情況。結果表明，在克氏原螯蝦眼柄切除誘導卵巢成熟的早期分子過程中，鈣信號通路可能發(fā)揮了重要作用。實驗結果為進一步深入研究克氏原螯蝦眼柄切除促進卵巢成熟的分子機制積累了研究資料。

關鍵詞：克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）；眼柄切除；卵巢成熟；實時定量PCR；鈣信號通路

中圖分類號：S917.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4846-04

CaM and PMCA might Be Involved in Induction of Procambarus clarkii Ovarian Maturation by Eyestalk Ablation in the Early Molecular Processes

GUAN Zheng-bing1，SHUI Yan2，ZHOU Xin2，3，XU Zeng-hong2，ZHAO Chao-yang2，LIAO Xiang-ru1

（1. School of Biotechnology， Jiangnan University， Wuxi 214122， Jiangsu， China； 2. Freshwater Fisheries Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences / Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization， Ministry of Agriculture， Wuxi 214081， Jiangsu， China； 3. Wuxi Fishery College， Nanjing Agricultural University， Wuxi 214081， Jiangsu， China）

Abstract：The molecular mechanism of induction to Procambarus clarkii ovarian maturation by eyestalk ablation is still unclear. Based on the recent studies， the 1， 7 and 15 days body length， weight and ovarian changes in P. clarkii after unilateral eyestalk ablation were explored， and the expression level of calmodulin（CaM） and plasma membrane Ca2+-ATPase genes（PMCA） in ovarian tissues before and after eyestalk ablation were analyzed by using real-time quantitative PCR. The results suggested that the calcium signaling pathway might play an important role in induction of P. clarkii ovarian maturation by eyestalk ablation in the early molecular processes. These data will be helpful for further in-depth studies of eyestalk ablation mechanism to induce ovarian maturation in P. clarkii.

Key words： Procambarus clarkii； eyestalk ablation； ovarian maturation； real-time quantitative PCR； calcium signaling pathway

甲殼動物的眼柄中存在著X器官-竇腺（X-organ sinus gland，XO-SG）復合體，該復合體是甲殼動物的神經(jīng)內分泌調控中心，能分泌與生長、蛻皮及性腺發(fā)育相關的多種激素[1]。其中，性腺抑制激素（Gonad-inhibiting hormone，GIH）對甲殼動物的性腺發(fā)育起主要調節(jié)作用，能夠抑制雌性動物卵巢卵黃原的合成及促性腺激素（Gonadotropins）的表達[2]。大量研究表明，通過切除甲殼動物眼柄進而破壞眼柄中X器官-竇腺復合體的功能，可以起到加速卵巢內卵黃積累、促進卵巢成熟的作用[3-6]。

但截至目前，國際上對甲殼動物切除眼柄后體內誘導性腺發(fā)育成熟的分子機制還知之甚少。2011年，Uawisetwathana等[7]基于cDNA芯片的轉錄組學方法研究了斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）單側眼柄切除前、后的基因組表達差異，發(fā)現(xiàn)在眼柄切除早期（1 d左右）參與鈣信號轉導基因（如CaM）、促激素分泌相關基因（如Thrombospondin）及發(fā)育過程相關基因（如Innexin2）的表達水平都大幅上調；隨后研究人員通過KEGG pathway分析，預測出與這些基因相關的促性腺激素釋放激素信號通路（Gonadotropin releasing hormone signaling pathway）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）及孕酮介導的卵母細胞成熟途徑（Progesterone-mediated oocyte maturation pathway）可能參與了眼柄切除后誘導斑節(jié)對蝦卵巢成熟的早期分子過程。

本研究借鑒上述國外最新研究結果，探討了克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）單側眼柄切除后卵巢的一系列變化情況，利用實時定量PCR技術比較分析了眼柄切除前、后卵巢組織中鈣調蛋白基因（CaM）與質膜Ca2+-ATPase基因（PMCA）的表達情況，初步明確在克氏原螯蝦中鈣信號通路是否參與了眼柄切除早期誘導卵巢成熟的分子過程，為進一步深入研究克氏原螯蝦眼柄切除促進卵巢成熟的分子機制積累了一定的研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用克氏原螯蝦雌蝦于2012年1月取自江蘇寶龍集團有限公司大豐養(yǎng)殖基地。選取體質健壯、活動力強、附肢完整的克氏原螯蝦雌蝦共40尾，體長為12.8～13.9 cm，體重為31.2～39.1 g。

1.2 方法

1.2.1 單側眼柄切除及相關指標測定 試驗蝦于實驗室暫養(yǎng)7 d，待其活動和攝食都正常后采用鑷燙法切除右側眼柄。切除過程如下：將醫(yī)用中號鑷子于酒精燈上燒至發(fā)紅狀態(tài)后對準雌蝦右側眼柄進行燙傷摘除，處理時間為35 s。分別于眼柄切除前（第0天）、切除后第1、7、15天隨機取10尾蝦，統(tǒng)計體長、體重、卵巢重量、性腺指數(shù)（Gonadosomatic index，GSI）等指標。

性腺指數(shù)=卵巢重量/體重×100%。

1.2.2 CaM及PMCA基因表達水平的測定 提取卵巢組織總RNA：活體解剖試驗蝦，分離卵巢組織，稱重后立即采用TRIzolTM試劑（Invitrogen， USA）提取總RNA樣品，置-80 ℃保存待用。

采用iScript SYBR Green One-Step RT-PCR 試劑盒（Bio-Rad，USA），運用實時定量PCR技術對各試驗組克氏原螯蝦卵巢組織中CaM及PMCA基因表達水平進行檢測。針對克氏原螯蝦CaM基因（GenBank登錄號：FJ179169）使用的檢測引物為：

5′-CAACGAAGTGGACGCTGAC-3′和5′-GGCTTCC

CTGATCTCTTCCT-3′，擴增片段大小為103 bp；針對克氏原螯蝦PMCA基因（GenBank登錄號：AY455931）使用的檢測引物為：5′-GCAAGTGGTGG

CTGTAACTGGT-3′和5′-ATGGGCTTCAATTCTGG

ATATG-3′，擴增片段大小為108 bp；內參基因18 S rDNA使用的檢測引物為：5′-TGGTGCATGGCCGTT

CTTA-3′和5′-AATTGCTGGAGATCCGTCGAC-3′。實時定量PCR的操作按照試劑盒說明書進行，反應條件均為：95 ℃ 預變性10 s；95 ℃變性30 s，60 ℃退火15 s ，共40個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。反應結束后設定閾值，利用SDS軟件V2.2版本輸出各檢測基因的Ct值；不同樣品CaM基因或PMCA基因與18 S rDNA基因Ct值的差值定義為ΔCt，設定表達量最低的試驗組為基準樣品（Calibrator），利用比較Ct值法（2-ΔΔCt法），最終獲得不同樣品與基準樣品間基因表達量的比值。

2 結果與分析

2.1 眼柄切除前、后克氏原螯蝦體長、體重及卵巢的變化

趙維信等[8]根據(jù)卵巢顏色變化、外觀特征、性腺指數(shù)等將克氏原螯蝦卵巢的發(fā)育過程分為5個時期，分別為：未發(fā)育期（Ⅰ期）、發(fā)育早期（Ⅱ期）、卵黃發(fā)生前期（Ⅲ期）、卵黃發(fā)生期（Ⅳ期）、成熟期（Ⅴ期）。依據(jù)此標準，于2012年1月對本研究取樣池塘進行大量雌蝦隨機解剖檢測（共檢測120尾），結果表明取樣池塘中的雌蝦卵巢絕大多數(shù)處于發(fā)育Ⅱ期，個別處于發(fā)育Ⅲ期。因此，基本可認為本研究所取40尾雌蝦的卵巢在單側眼柄切除前處于發(fā)育Ⅱ期。

由表1可知，從單側眼柄切除前至切除后的第15天，克氏原螯蝦雌蝦體長和體重增長不顯著，體長由（13.5±0.4） cm增加至（14.2±0.7） cm，體重由（35.2±3.8） g增加至（40.5±6.8） g；相反，卵巢重量增加非常顯著（P<0.05），由（0.3±0.1） g增加至（1.9±0.6） g，從而使性腺指數(shù)由（0.9 ± 0.2）%增長至（4.7±2.3）%，表明眼柄切除確實促進了雌蝦卵巢的快速發(fā)育成熟。

觀察不同時間卵巢外觀特征可見：眼柄切除前卵巢呈白色至淺黃色，細線狀，卵粒少，無卵黃顆粒，處于發(fā)育Ⅱ期；眼柄切除后第1天卵巢呈淡黃色至黃色，線狀或條狀，出現(xiàn)卵黃顆粒，表明此時基本處于發(fā)育Ⅲ期；切除后第7天卵巢呈黃色至深褐色，棒狀，卵巢占據(jù)胸腔的1/2～3/4，卵黃顆粒大量生成，顯示此時處于發(fā)育IV期；切除后第15天卵巢呈深褐色至黑色，粗棒狀，占據(jù)整個胸腔，卵細胞圓形且飽滿，卵徑1.5 mm以上，卵黃顆粒充滿整個卵細胞，表明此時卵巢已發(fā)育成熟，處于發(fā)育V期。

2.2 眼柄切除前、后卵巢組織中CaM及PMCA基因表達水平的變化

由圖1可知，克氏原螯蝦雌蝦眼柄的切除均大幅誘導了卵巢組織中CaM及PMCA基因表達水平的上調，兩者在眼柄切除后的第1天表達水平最高，分別為眼柄切除前的8.7倍和13.2倍；隨后表達水平逐漸下降，切除后第7天CaM及PMCA基因表達水平分別為切除前的5.1倍和9.2倍；切除后第15天兩者幾乎回到了眼柄切除前的表達水平，分別僅為切除前的1.1倍和1.4倍。以上結果表明，CaM與PMCA可能主要參與眼柄切除誘導克氏原螯蝦卵巢成熟的早期分子過程。

3 討論

本試驗中克氏原螯蝦雌蝦在單側眼柄切除后第15天卵巢已呈粗棒狀，顏色為深褐色至黑色，卵巢飽滿并占據(jù)整個胸腔，卵黃顆粒大且充滿整個卵細胞，核仁可見，表明此時卵巢已發(fā)育成熟。值得注意的是，雌蝦卵巢重量在眼柄切除后的第7天至第15天增長最為顯著，由（0.8±0.3） g增長至（1.9 ±0.6） g，表明此期間卵巢急速積累卵黃物質（主要包括蛋白質和脂類）。從卵巢發(fā)育成熟時間上來看，切除眼柄雌蝦比不切除眼柄雌蝦卵巢成熟時間提早2～3個月[9]。

在克氏原螯蝦蝦苗人工繁育過程中，親蝦成活率低，產(chǎn)卵、孵化同步性差，育苗產(chǎn)量低等是目前制約克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖的突出問題[10]。在天然環(huán)境條件下，1齡幼蝦性腺發(fā)育需6～12個月達到成熟，雌雄發(fā)育基本同步。但是在人工養(yǎng)殖條件下，存在雌、雄蝦生長和性腺發(fā)育不同步現(xiàn)象：雄性個體發(fā)育及性成熟明顯早于雌性，并且雄蝦精巢能自然成熟且精子質量與野生蝦相比沒有顯著差異，可充當親本；但是雌蝦卵巢常發(fā)生發(fā)育遲緩甚至停滯，即使在順利完成交配以后還需再發(fā)育2～5個月方可產(chǎn)卵。通過人工催熟的方法，如去除單側眼柄能在一定程度上促進卵巢的發(fā)育成熟和批量排卵[6，11]，但在養(yǎng)殖生產(chǎn)實踐中常發(fā)現(xiàn)眼柄切除后易造成雌蝦蛻皮周期縮短、生長受到抑制、死亡率上升等不良后果。因此，尋找促進卵巢成熟的方法是經(jīng)濟蝦蟹類人工飼養(yǎng)產(chǎn)業(yè)的長期目標。深入理解眼柄切除促進卵巢成熟的分子機理是找到合理的、可替代方法的前提和基礎。

CaM是細胞內鈣信號傳導途徑中的主要信號轉導分子，介導調控由Ca2+引起的一系列生理生化反應，參與并調節(jié)細胞的增生、分化、運動等基本代謝過程；PMCA在細胞內的主要作用是在信號刺激后做精細的排Ca2+掃尾工作，并長效地維持靜息狀態(tài)下細胞內的Ca2+濃度，受到CaM的正調控[12]。有研究報道，在大鼠、兩棲動物及魚類卵母細胞成熟的早期過程中，CaM通過與Ca2+結合而激活鈣調蛋白激酶（CaM kinase），導致細胞釋放促性腺素類激素，從而促進卵泡生長以及雌二醇和孕酮的生成；卵泡細胞分泌產(chǎn)生的孕酮通過孕酮介導的卵母細胞成熟途徑活化細胞分裂周期蛋白2、周期蛋白B等卵母細胞成熟促進因子（Maturation-promoting factors， MPFs）誘導卵母細胞發(fā)育成熟[13]。本研究利用實時定量PCR技術監(jiān)測CaM及PMCA基因在克氏原螯蝦眼柄切除前、后卵巢組織中表達水平的變化，結果顯示CaM及PMCA基因在眼柄切除早期被大量誘導表達，表明鈣信號通路可能也在甲殼動物克氏原螯蝦卵巢發(fā)育成熟的早期過程中發(fā)揮重要作用。

克氏原螯蝦卵泡細胞中鈣信號通路的誘導激活推測是由體內的促性腺激素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone，GnRH）類似物引發(fā)的，因為GnRH在哺乳動物、兩棲動物及魚類中的主要功能是控制卵泡刺激素（FSH）和黃體生成素（LH）的釋放，在性別分化、性腺發(fā)育以及生殖過程中起重要調節(jié)作用[14]?？耸显r單側眼柄被切除后可能使得GnRH表達量上調，從而通過與卵泡細胞表面的GnRH受體結合進而激活鈣信號通路。當然，要最終明確鈣信號通路在克氏原螯蝦雌蝦眼柄切除后誘導卵巢成熟早期過程中的作用和調控機制，還需進一步進行深入研究探討，如可利用RNA干擾（RNA interference）技術抑制CaM的表達來研究其作用。

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收稿日期：2012-07-24

基金項目：國家自然科學基金項目（31101331）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003070）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項

（2011JBFB02）；江蘇省自然科學青年基金項目（BK2012090）

作者簡介：管政兵（1981-），男，湖南常德人，副教授，博士，主要從事生物化學與分子生物學相關研究工作，（電話）15061812230

（電子信箱）guanzhengbing@yahoo.com.cn。