摘要：采用蔗糖密度梯度離心法分離純化斑點叉尾鯝病毒（Channel catfish virus， CCV），利用電噴霧-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF MS/MS）對得到的樣品進(jìn)行分析。結(jié)果共鑒定了13種結(jié)構(gòu)蛋白，包含1種未報道過的結(jié)構(gòu)蛋白ORF22。實驗結(jié)果為進(jìn)一步研究CCV結(jié)構(gòu)蛋白的功能及蛋白質(zhì)組學(xué)提供了參考。

關(guān)鍵詞：斑點叉尾鯝病毒（Channel catfish virus，CCV）；結(jié)構(gòu)蛋白；蔗糖密度梯度離心；質(zhì)譜

中圖分類號：S941.41+9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4841-05

Identification of Structural Proteins of Channel Catfish Virus （CCV）

BI Peng，WU Zhi-xin，SU Nian，LI Li-juan

（College of Fisheries， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： Channel catfish virus （CCV） in channel catfish ovary cells were purified through sucrose density gradient centrifugation， and then analyzed using the ESI-Q-TOF mass spectrometry technique. Totally， 13 structural proteins were identified， including a novel structural protein ORF22. This study provided a good reference to further study the function of structural proteins and proteomics of the CCV.

Key words： channel catfish virus（CCV）； structural proteins； sucrose density gradient centrifugation； mass spectrometry

隨著我國斑點叉尾鯝養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，其病害也日趨嚴(yán)重，已成為制約鯝魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素[1]。斑點叉尾鯝病毒?。–hannel catfish virus disease， CCVD）具有傳染快、死亡率高等特點，其病原為斑點叉尾鯝病毒（Channel catfish virus， CCV），主要感染魚苗和魚種。該病的病程比較短，一般為3～7 d，當(dāng)飼養(yǎng)水溫在25～30 ℃時疾病呈流行高峰，死亡率可達(dá)到90%以上[2]。CCV的傳播方式主要有兩種，即通過與疫水和患病魚體接觸進(jìn)行水平傳播以及經(jīng)受精卵垂直傳播[3]。1968年Fijan首次對CCV進(jìn)行分離，隨后Wolf和Darlington[4]根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征鑒定為皰疹病毒。盡管CCV在結(jié)構(gòu)上和人類單純皰疹病毒1型（HSV-1）相似，但是兩者核苷酸和氨基酸序列差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[5]。2009年，國際病毒分類委員會（ICTV）將CCV從α-皰疹病毒亞科中分離出來，并且將其分類地位劃分為魚類皰疹病毒科（Alloherpesviridae）鯝魚皰疹病毒屬（Ictalurid herpesvirus）[6]。CCV是一種雙鏈DNA病毒，病毒粒子大小約為175～200 nm，由囊膜、間層和核衣殼組成。核衣殼呈二十面體結(jié)構(gòu)，由162個直徑約為100 nm的殼粒組成[7]。CCV的基因組大小約為134 kb，整個基因組預(yù)測由76個開放閱讀框（Open reading frame，ORF）組成。

蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者，是生命活動的體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡明機體在生理或病理條件下的變化機制[8]。目前，國內(nèi)已有較多關(guān)于CCV研究的相關(guān)報道，以CCVD的防治對策研究為主。同時，也有部分CCV檢測方法的研究，如李惠芳等[9]建立了TaqMan實時熒光PCR檢測方法，杜玉東等[10]對CCV核酸探針檢測方法進(jìn)行了研究。除此之外，相關(guān)CCV多克隆抗體的制備[11]以及CCV“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建[12]等研究也得到開展。盡管如此，國內(nèi)對CCV結(jié)構(gòu)蛋白的相關(guān)研究相當(dāng)匱乏。Davison等[5]早在1995年就對純化的CCV病毒粒子進(jìn)行了SDS-PAGE分析，并利用基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）質(zhì)譜法鑒定了11種結(jié)構(gòu)蛋白。隨后，Kunec等[13]利用高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-ESI-MS/MS）對CCV病毒粒子進(jìn)行了分析，鑒定了37種結(jié)構(gòu)蛋白。其中，囊膜蛋白有ORF10、ORF46和ORF59；核衣殼蛋白有ORF27、ORF28、ORF39和ORF53等；間層蛋白有ORF11、ORF12和ORF65等。也有很多學(xué)者對其他皰疹病毒進(jìn)行了相關(guān)研究，如Varnum等[14]通過對巨細(xì)胞皰疹病毒（HCMV）粒子的研究鑒定了5種核衣殼蛋白、14種間層蛋白和19種糖蛋白；而Stefania等[15]則鑒定并定位了HSV-1的糖蛋白B促融合基因位點，為病毒入侵機理的研究提供了參考，也為基因疫苗的開發(fā)制備奠定了基礎(chǔ)。雖然CCV近一半的ORF被報道，但是還有很多ORF未被報道，因此，通過質(zhì)譜技術(shù)不斷發(fā)現(xiàn)、鑒定新的CCV結(jié)構(gòu)蛋白，不僅從表觀上完善了CCV各組分的蛋白質(zhì)組成，也為下一步確定CCV各組分特別是囊膜蛋白的蛋白質(zhì)組成以及疫苗的開發(fā)提供基礎(chǔ)，同時也為進(jìn)一步研究病毒入侵機理以及基因藥物的研發(fā)提供了重要的理論依據(jù)。本研究采用蔗糖密度梯度離心法分離純化斑點叉尾鯝病毒，利用電噴霧-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF MS/MS）對得到的樣品進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究CCV結(jié)構(gòu)蛋白的功能及蛋白質(zhì)組學(xué)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的斑點叉尾鯝卵巢細(xì)胞（CCO）和斑點叉尾鯝病毒（CCV）為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院細(xì)胞保藏中心保存。

1.2 病毒的分離與純化

以CCO為宿主，用于培養(yǎng)CCV。樣品收集后凍存于-80 ℃，室溫凍融后于4 ℃ 8 000 r/min離心30 min，取上清并于4 ℃ 28 000 r/min 離心3 h，去上清后將沉淀溶于1～2 mL TNE（0.5 mol/L Tris-HCl， 0.1 mol/L NaCl， 0.01 mol/L EDTA， pH 7.4）緩沖液中，混勻，即為病毒粗提液。將病毒粗提液轉(zhuǎn)移至蔗糖密度梯度離心管，蔗糖濃度梯度分別為20%、30%、40%、50%、60%（m/m），然后于4 ℃ 40 000 r/min進(jìn)行密度梯度離心2 h，吸取病毒條帶，加入適量TNE，混合均勻后再次于4 ℃ 40 000 r/min離心1.5 h，將得到的沉淀溶于40 μL TNE中，即為純化的病毒液。

1.3 電鏡觀察

取純化的病毒液用2%（m/V）的磷鎢酸溶液染色5 min，室溫自然干燥后在透射電子顯微鏡（日立H-5760）下觀察。

1.4 SDS-PAGE分析

取30 μL純化病毒液，加6×Buffer 6 μL，沸水變性處理10 min后采用恒流方式進(jìn)行SDS-PAGE分析，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)凝膠底部時停止電泳，取下凝膠后采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色和脫色，脫色至凝膠背景透明，用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠掃描成像。

1.5 質(zhì)譜分析

將凝膠上的目的條帶切下，送往武漢大學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)及質(zhì)譜學(xué)共享實驗室進(jìn)行質(zhì)譜分析。按照Shevchenko等[16]的方法進(jìn)行膠內(nèi)酶解。然后利用電噴霧-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（ESI-Q-TOF MS/MS）進(jìn)行結(jié)構(gòu)蛋白的鑒定。采用飛行時間模式進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，一級質(zhì)譜進(jìn)行母離子檢測，二級質(zhì)譜進(jìn)行碎片峰檢測，二級質(zhì)譜的質(zhì)量容忍度為0.4 Da，最多允許2個酶切位點的遺漏。通過與Swissport數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。

2 結(jié)果

2.1 CCV的分離與純化

蔗糖密度梯度離心后可以清晰地看到1條乳白色的病毒條帶（圖1），位于50%和60%蔗糖梯度之間。將純化病毒液進(jìn)行負(fù)染，電鏡下顯示病毒粒子呈圓形或橢圓形，病毒粒子的直徑為175～200 nm，具囊膜及典型的皰疹病毒特征（圖2）。

2.2 CCV的SDS-PAGE分析結(jié)果

取適量純化的病毒液進(jìn)行SDS-PAGE分析，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行染色和脫色，可見約17個蛋白條帶（圖3）。

2.3 CCV的質(zhì)譜分析結(jié)果

在PAGE凝膠中大多數(shù)蛋白條帶都與被鑒定結(jié)構(gòu)蛋白一一對應(yīng)，即一個蛋白條帶對應(yīng)一種結(jié)構(gòu)蛋白。少數(shù)蛋白并不呈現(xiàn)這種對應(yīng)關(guān)系，其中第八、九、十這三個蛋白條帶對應(yīng)的是ORF66，可能是蛋白質(zhì)的降解所致；第15和16兩個條帶中檢測到4種結(jié)構(gòu)蛋白，但是由于電泳的分辨率不夠，不能形成清晰的蛋白條帶并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，還有可能是由其他大分子量的蛋白質(zhì)降解而產(chǎn)生分子量小的ORF，因此質(zhì)譜能夠檢測到4種ORF，但是不能進(jìn)行一一鑒定。對ESI-Q-TOF MS/MS得到的結(jié)果進(jìn)行分析，共鑒定出CCV的13種結(jié)構(gòu)蛋白（表1）。主要包括：2種膜蛋白（1種囊膜蛋白ORF59，為CCV的主要囊膜蛋白，另外1種為糖蛋白ORF46，Kuctktas等[7]通過對CCV基因序列分析顯示，ORF46攜帶26個N-糖基化位點，為CCV的糖蛋白，可能在病毒入侵宿主時起重要作用）、5種間層蛋白（ORF74、ORF73、ORF72、ORF65和ORF15）以及3種核衣殼蛋白（ORF39、ORF53和ORF27，其中，ORF39為主要的核衣殼蛋白），另外還有2種已報道但是未對其功能描述的蛋白，分別是ORF66和ORF79。此外，質(zhì)譜還發(fā)現(xiàn)了1種從未被報道的蛋白ORF22，其結(jié)構(gòu)和功能都尚未被描述。

3 討論

CCV是一種具囊膜的皰疹病毒，由于囊膜在提取過程中容易脫落，因此在提取時應(yīng)盡量使用新鮮的病毒培養(yǎng)液，避免反復(fù)凍融造成病毒粒子的破損[17]。目前提取病毒的方法很多，主要有沉淀法、離心法和層析法等。文明等[18]分別采用沉淀法、層析法、差速離心法和蔗糖不連續(xù)密度梯度離心法提純病毒粒子，發(fā)現(xiàn)不連續(xù)密度梯度離心法可分離純化病毒粒子，電鏡下可見少量、大小一致的完整病毒粒子；姜有聲等[19]使用蔗糖密度梯度離心法純化得到大量對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）。Tasi等[20]對WSSV病毒粒子進(jìn)行蔗糖密度梯度離心，負(fù)染后電鏡觀察表明，完整病毒粒子的純度很高，約為96%，其他的4%為不成熟的病毒粒子形態(tài)。因此，本實驗采用了蔗糖密度梯度離心法純化病毒，得到了大量純化的完整的CCV病毒粒子，但是電鏡圖片中顯示還有一些無囊膜包被裸露的顆粒，可能是提純過程中由于囊膜脫落而形成的核衣殼顆粒[19，21]。

Davison等[5]通過MALDI質(zhì)譜法鑒定了11種結(jié)構(gòu)蛋白，本實驗共鑒定了13種結(jié)構(gòu)蛋白，包含1種未被報道的結(jié)構(gòu)蛋白。造成這種差異可能是由于實驗中采用了靈敏度更高、范圍更廣的ESI-Q-TOF MS/MS，還可能和純化的CCV純度以及凝膠電泳的條件有關(guān)。另外，Davison等[5]的實驗結(jié)果顯示，質(zhì)譜鑒定的CCV結(jié)構(gòu)蛋白分子量與理論值相差最小約2 kDa，最大約27 kDa，這可能是由于在進(jìn)行質(zhì)譜分析前樣品中蛋白質(zhì)修飾作用比較明顯所致。本實驗中蛋白質(zhì)分子量與理論值保持了較高的一致性，相差1 kDa左右，真實地反映了CCV的分子特性。Kunec等[13]通過LC-ESI MS/MS質(zhì)譜法鑒定了37種結(jié)構(gòu)蛋白，本實驗采用SDS-PAGE分離病毒蛋白，可能造成一些低豐度和分子量小的蛋白質(zhì)未被檢測到[22]，從而導(dǎo)致被鑒定的蛋白質(zhì)數(shù)目減少，因此只鑒定到13種結(jié)構(gòu)蛋白。另外，Kunec等[13]對CCO和被CCV感染的CCO的蛋白質(zhì)同時進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，然后進(jìn)行差減得出CCV的結(jié)構(gòu)蛋白數(shù)目，這樣避免了因其他實驗操作而使一些蛋白質(zhì)被遺漏。本實驗中使用SDS-PAGE聯(lián)合質(zhì)譜的方法和目前研究蛋白質(zhì)組學(xué)較常見的雙向電泳串聯(lián)質(zhì)譜的研究方法相比，靈敏度相對較低，范圍也較小，容易造成小分子ORF的丟失。因此，對CCV主要的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行鑒定，對小分子ORF的鑒定需要更多后續(xù)研究。

質(zhì)譜結(jié)果顯示凝膠中的第六個蛋白條帶有兩種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是ORF46和ORF73。在對其進(jìn)行鑒定時，雖然ORF46分子量與在凝膠中上下條帶的蛋白分子量比對稍微有些出入，但是在質(zhì)譜分析時發(fā)現(xiàn)ORF46有較高的檢索分?jǐn)?shù)以及較多相匹配的肽段，因此將ORF46作為候選蛋白。在第八、九、十這三個蛋白條帶中，第八個條帶豐度最大，其中ORF66檢索分?jǐn)?shù)最高且豐度大，其余的蛋白和鑒定過的蛋白重復(fù)或者分值很低，出現(xiàn)3個條帶可能是由于在SDS-PAGE電泳過程中蛋白質(zhì)發(fā)生了降解。因此鑒定這3個條帶的結(jié)構(gòu)蛋白為ORF66。在第15和第16兩個條蛋白條帶中檢測到4種結(jié)構(gòu)蛋白，分別為ORF7、ORF10、ORF11和ORF19，其中，ORF7、ORF10和ORF19是與囊膜相關(guān)的結(jié)構(gòu)蛋白，但是這4種結(jié)構(gòu)蛋白檢索分?jǐn)?shù)都很低，而且匹配的肽段不多，僅僅通過SDS-PAGE分析和現(xiàn)有的質(zhì)譜結(jié)果還不能將其一一鑒定出來，很可能是由于大部分的囊膜蛋白被降解從而產(chǎn)生了小分子量的多肽。

CCV基因組預(yù)測含有76個ORF，間層蛋白在CCV的生命活動中扮演著極其重要的作用，如傳遞病毒的基因組、調(diào)控某些基因的表達(dá)、促進(jìn)病毒囊膜的形成以及協(xié)助病毒入侵等[23]，在CCV的76個ORF中，有近一半為間層蛋白，這可能與間層蛋白在CCV整個生命活動中的重要作用有關(guān)。本實驗共鑒定了5種間層蛋白，包括ORF15、ORF65、ORF72、ORF73和ORF74。鑒于間層蛋白在CCV生命活動中的重要作用，對各個間層蛋白的研究以及與其他蛋白之間相互作用的研究可能會進(jìn)一步揭示其功能。另外，通過質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)了一種新的結(jié)構(gòu)蛋白ORF22，分子量約為153 kDa，和理論分子量保持了一致性。Davison等[5]和Kunec等[13]均未檢測到這種結(jié)構(gòu)蛋白，可能是由于所采用的質(zhì)譜精確度和靈敏度不一樣引起的。關(guān)于ORF22是否是一種新的病毒結(jié)構(gòu)蛋白以及其分子生物學(xué)特征和相關(guān)功能需要進(jìn)一步研究。目前CCV基因組的ORF只有部分通過實驗被人們所認(rèn)知，大部分的ORF還未被報道，因此，通過質(zhì)譜不斷發(fā)現(xiàn)、鑒定新的結(jié)構(gòu)蛋白，既是對CCV基因組內(nèi)容上的補充，也是對結(jié)構(gòu)蛋白在CCV生命活動中所起的作用以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用等蛋白質(zhì)組學(xué)研究內(nèi)容的豐富。

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收稿日期：2012-05-18

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（30700624）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目（2012ZYTS028）

作者簡介：畢 鵬（1986-），男，湖北浠水人，在讀碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)動物醫(yī)學(xué)，（電話）13554125682（電子信箱）hbxsbp@163.com；

通訊作者，李莉娟，（電子信箱）lilijuan@mail.hzau.edu.cn。