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        轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的技術(shù)思路

        2012-12-31 00:00:00劉西梅喬憲鳳張立蘋程妮畢延震李莉肖紅衛(wèi)華再東華文君
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年21期

        摘要:從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的目的出發(fā),探討轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的不同思路,分析使用各種載體所考慮的基本出發(fā)點(diǎn),說明受體動(dòng)物遴選所需要考慮的因素,總結(jié)了轉(zhuǎn)基因方法的技術(shù)特點(diǎn),提出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物檢測手段的設(shè)計(jì)原則,論述了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁殖的必要性,為從事轉(zhuǎn)基因動(dòng)物方面的研究提供技術(shù)思路。

        關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)基因動(dòng)物;轉(zhuǎn)基因方法;技術(shù)思路

        中圖分類號(hào):Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2012)21-4837-04

        Technology Program of Transgenic Animal

        LIU Xi-mei,QIAO Xian-feng,ZHANG Li-ping,CHENG Ni,BI Yan-zhen,LI Li,XIAO Hong-wei,

        HUA Zai-dong,HUA Wen-jun

        (Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Hubei Academy of Agricultural Sciences /Hubei Key Lab of Animal Embryo and Molecular Breeding,Wuhan 430064,China)

        Abstract: Different thoughts on the research of transgenic animal were discussed. It included the basic starting point and factors need to considered in the selection of various carriers and recipient animals, the summary of transgenic techniques, the design principles for transgenic animal detection, the necessity of transgenic animal breeding, etc. It provided a technical idea for the research of transgenic animals.

        Key words: transgenic animal; transgenic technology; technical idea

        轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備的主要技術(shù)步驟包括目的基因的分離與克??;表達(dá)載體的構(gòu)建;受體細(xì)胞的獲得;基因?qū)耄皇荏w動(dòng)物的選擇及轉(zhuǎn)基因胚胎的移植;轉(zhuǎn)基因整合表達(dá)的檢測;轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的性能觀測及轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物的分離與純化;轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的遺傳性能研究以及性能選育;組建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物新類群等。30多年的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究歷程[1],轉(zhuǎn)基因技術(shù)日新月異,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的品種多種多樣,轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因五花八門,涉及的領(lǐng)域超乎想象,遇到的問題層出不窮、千奇百怪。人們從初期的興奮、中期的熱血沸騰到現(xiàn)階段的冷靜思考,研究成果正步步趨近我們的生活。然而,在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中總會(huì)遇到這樣或那樣的一系列棘手問題,有時(shí)因初始設(shè)計(jì)的缺陷,研究項(xiàng)目到中后期才察覺問題的嚴(yán)重性而不得不終止對(duì)該項(xiàng)目的研究,這是該類研究進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化艱難的重要原因之一[2]。為了省時(shí)省力,少走彎路,避免造成人力、物力、財(cái)力的巨大浪費(fèi),應(yīng)選擇正確的設(shè)計(jì)思路、運(yùn)用得當(dāng)?shù)姆椒?,才能較好地完成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究工作。在此就轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的技術(shù)思路進(jìn)行探討,以供參考。

        1 研究的目的

        轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究及應(yīng)用的目的決定其研究的總體方向,無論是以軍用還是民用發(fā)展為目的,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究總體可分為五大類型,即動(dòng)物育種、動(dòng)物生物反應(yīng)器、觀賞寵物、醫(yī)學(xué)模型、基因功能研究等。不同類型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的技術(shù)思路不盡相同。

        1.1 動(dòng)物育種類

        轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種,特別是供應(yīng)消費(fèi)者肉、奶、蛋等之類的動(dòng)物如牛、豬、雞、魚等的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種,其優(yōu)先技術(shù)思路是無標(biāo)記基因,如綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、卡那霉素抗性(kan)、病毒載體骨架及相關(guān)的DNA片段等,這主要是考慮到產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)問題,一旦帶有這類標(biāo)記的動(dòng)物形成,清除標(biāo)記是非常費(fèi)勁的工作,難以通過安全性評(píng)價(jià)。如帶有氨芐青霉素(amp)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物抗藥性增加、帶GFP的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物過敏原增加;其次還需考慮基因功能如何發(fā)揮,如用促生長、抗病、環(huán)保、軍用(蜘蛛絲蛋白防彈衣)的基因,動(dòng)物的生長極限、育種進(jìn)度能否跟上病原進(jìn)化的速度,環(huán)保及軍用產(chǎn)品的比較效益等,如抗瘋牛病的轉(zhuǎn)基因牛(敲除朊病毒蛋白基因的牛)的研究進(jìn)程沒有瘋牛病病毒基因的變異快,將來培育的這種轉(zhuǎn)基因牛品種(10~15年后)無法確定能抗瘋牛病[3];再者是考慮轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生存及競爭安全,如在現(xiàn)有的生產(chǎn)模式下,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能否在同類動(dòng)物中正常生存(包括生長發(fā)育、繁殖、采食、抵抗力、攻擊與被攻擊等)及飼養(yǎng)的可控制性,其中典型的例子是轉(zhuǎn)基因魚因生長快速,使同類野生型魚的生存失去優(yōu)勢而難以進(jìn)入生態(tài)大環(huán)境,將導(dǎo)致野生魚生存空間越來越??;同時(shí)天敵掠走轉(zhuǎn)基因動(dòng)物形成基因漂移也是潛在的風(fēng)險(xiǎn)。

        1.2 動(dòng)物生物反應(yīng)器類

        以動(dòng)物生物反應(yīng)器為目的的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究,由于其目的蛋白的附加值高,動(dòng)物本身的剩余價(jià)值非常有限,動(dòng)物的殘次值可以不予考慮。主要的技術(shù)思路:一是表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu),利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的絕大多數(shù)是蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)形成只有與原出處(天然細(xì)胞)結(jié)構(gòu)一樣(一、二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu))才有實(shí)際價(jià)值,否則試驗(yàn)就不算成功。如轉(zhuǎn)基因豬表達(dá)的人血紅蛋白四級(jí)結(jié)構(gòu)有偏差,攜氧量非常低,就未能達(dá)到預(yù)期的試驗(yàn)?zāi)康腫4];表達(dá)的蜘蛛絲蛋白結(jié)構(gòu)錯(cuò)位,制成的防彈衣遠(yuǎn)不如天然產(chǎn)物效果好[5]。二是表達(dá)量,這一指標(biāo)常取決于將來的開發(fā)價(jià)值,一般pg、ng、μg級(jí)表達(dá)量基本沒有太大利用價(jià)值,但不表明越高越好,一旦過高,可能影響動(dòng)物的正常生理生化及代謝,甚至危及生命,在動(dòng)物能忍受的極限內(nèi)則表達(dá)量越高越好。三是穩(wěn)定表達(dá),在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)穩(wěn)定及個(gè)體表達(dá)差異較小時(shí),初級(jí)產(chǎn)品的后加工相對(duì)簡單一些,如抽樣檢測、產(chǎn)品生產(chǎn)工藝等易于定型,如mg與g表達(dá)差異的其制備蛋白工藝相差甚遠(yuǎn),提取成本也將有明顯差異。四是時(shí)效性,對(duì)于不同類型的生物反應(yīng)器,表達(dá)的時(shí)效性完全不同,如血液、尿液[3]、腹腔液、淚液等為終生表達(dá)產(chǎn)物,乳腺類的只在泌乳時(shí)乳汁里含有表達(dá)產(chǎn)物,雞蛋類只在產(chǎn)蛋后的雞蛋中有目的蛋白,精液類只在公畜性成熟后能檢測到表達(dá)產(chǎn)物。五是分離純化難易程度,按照產(chǎn)物的易得程度、重復(fù)使用性、產(chǎn)量高低、產(chǎn)物單位生產(chǎn)成本排序,優(yōu)先順序是乳腺、雞蛋、尿液、精液、腹腔液、血液、淚液、組織臟器等;依終端產(chǎn)品提純成本排序,優(yōu)先順序是尿液、精液、乳腺、雞蛋、腹腔液、淚液、血液、組織臟器等;根據(jù)初級(jí)產(chǎn)品的保存、運(yùn)輸難易程度排序,優(yōu)先順序是雞蛋、乳腺、精液、尿液、淚液、腹腔液、血液、組織臟器等。所有這些的前提是在立項(xiàng)前要考慮當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)是否適合所選的反應(yīng)器類型,如在熱帶用奶牛乳腺作為生物反應(yīng)器是不可取的方案,因?yàn)榇嬖陲暡莘潜镜鼗曫B(yǎng)成本高、初級(jí)產(chǎn)品牛奶儲(chǔ)運(yùn)難等問題[1,6]。

        1.3 觀賞寵物類

        轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研制效率低,成本相對(duì)較高,所以培育觀賞及寵物類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物從技術(shù)思路上考慮動(dòng)物來源較容易,觀賞價(jià)值較大,但要注意不能帶入新的過敏原和潛在病原,還需兼顧避免基因漂移。如轉(zhuǎn)基因有色猴、狗等不可帶入易傳染給人的疾病病原,轉(zhuǎn)基因花斑魚無意中進(jìn)入不可控水系也是有風(fēng)險(xiǎn)的[7]。

        1.4 醫(yī)學(xué)模型類

        包括疾病模型和異種器官移植。前者技術(shù)限制比較少,只要轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能活、可控即可,一般技術(shù)思路是表型明顯,遺傳比較穩(wěn)定,特殊情況下可以不考慮遺傳穩(wěn)定問題,但一定要能代表目的疾病實(shí)際情況,目前小鼠作模型比較實(shí)用。而異種器官移植的技術(shù)思路比較復(fù)雜,一是與人器官的解剖、生理、代謝規(guī)律要相似,以便將來的器官能移植到人體內(nèi)。二是要同時(shí)考慮兼顧動(dòng)物育種和觀賞寵物類的技術(shù)特點(diǎn)。三是減少、避免人畜共患病,杜絕病原從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物器官傳染給人的途徑。四是要成本低,取材方便,易于飼養(yǎng),又能建立SPF群體。綜合考慮,豬是比較好的候選對(duì)象[8]。

        1.5 基因功能研究類

        這類研究的技術(shù)思路是:一是快捷,即能在最短的時(shí)間內(nèi)得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,并驗(yàn)證功能。二是易于對(duì)轉(zhuǎn)基因個(gè)體進(jìn)行檢測,可以通過標(biāo)記、表型等建立可視化的檢測手段。三是雙等位轉(zhuǎn)(剔除)基因動(dòng)物最理想,這種情況更能有效地驗(yàn)證基因的功能。四是可重復(fù)性,由于功能驗(yàn)證研究的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不一定要遺傳穩(wěn)定,甚至不需要傳代就能證明目的基因的功能,但試驗(yàn)的可重復(fù)性是不可回避的,即在不同批次的試驗(yàn)中能得到相同的結(jié)果。

        2 載體

        對(duì)于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究來說,載體是指進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有效的DNA或RNA,這與一般細(xì)菌轉(zhuǎn)化中的載體完全不同,在細(xì)菌中操作的那部分DNA片段對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來說是非必需的,有時(shí)它還會(huì)影響轉(zhuǎn)基因的效果。一般技術(shù)思路是:一是用于原核注射、脂質(zhì)體、磷酸鈣、電轉(zhuǎn)移的載體優(yōu)先選無原核部分的完整表達(dá)框,即啟動(dòng)子—目的基因—終止子,這一結(jié)構(gòu)效率比較高,有效結(jié)構(gòu)為裸DNA。二是體細(xì)胞克隆需要篩選標(biāo)記來篩選陽性供體細(xì)胞,再加上完整的表達(dá)框,如果是定位整合或剔除載體還需定位區(qū)特定DNA片段和正負(fù)篩選標(biāo)記,只有這樣才能達(dá)到定位的目的,有效結(jié)構(gòu)多為裸DNA。三是病毒載體的病毒骨架和完整的表達(dá)框,有效結(jié)構(gòu)多為包裝性載體,這類載體的整合效率較高,有些達(dá)到100%,常常通過包裝后,形成病毒顆粒而達(dá)到轉(zhuǎn)基因目的,整體結(jié)構(gòu)包括缺陷病毒DNA和含目的基因的表達(dá)載體框兩部分,有時(shí)還有篩選標(biāo)記、定位DNA片段等。四是其他方法中涉及到的特殊DNA片段也是必需的,如鋅指核酸酶(ZEN)、轉(zhuǎn)錄激活樣因子核酸酶(TALEN)等需要相應(yīng)的DNA片段介導(dǎo)[2,6]。

        3 受體動(dòng)物

        轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究時(shí),受體動(dòng)物的遴選影響研究周期、投入大小、成功的幾率等。

        按研究周期及投入計(jì),其技術(shù)思路中動(dòng)物排序的優(yōu)先順序是斑馬魚、小鼠、豬、雞、羊、牛等動(dòng)物;以基因功能驗(yàn)證為主進(jìn)行試驗(yàn)時(shí),斑馬魚最有效;以疾病及哺乳動(dòng)物基因功能研究為主時(shí),小鼠效率最高;而生物反應(yīng)器的研究則以牛、羊的總效益最明顯。根據(jù)不同的用途,轉(zhuǎn)基因研究受體動(dòng)物選擇的技術(shù)思路是:魚、鼠—基因功能驗(yàn)證;鼠、豬—疾病模型;豬—異種器官移植;雞、豬、羊、奶牛—生物反應(yīng)器,生產(chǎn)為軍用或民用特種蛋白;魚、雞、豬、羊、?!r(nóng)業(yè)育種,改善生產(chǎn)性能。各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究周期:魚為10 d,鼠為24 d,豬為121 d,雞為25 d,羊?yàn)?56 d,牛為293 d[8,9]。

        4 轉(zhuǎn)基因方法

        根據(jù)載體及所轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的用途,轉(zhuǎn)基因方法的技術(shù)思路是:一是顯微注射法,該方法包括原核注射、BAC注射、YAC注射、染色體注射、微球注射等,其實(shí)質(zhì)就是把DNA注射到動(dòng)物的原核期胚胎中,這一方法的技術(shù)特點(diǎn)是能夠轉(zhuǎn)移任意大小的基因,即能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)從小到大所有DNA,大到上千kb(千堿基),小至幾個(gè)bp(堿基),包括RNA等,只是該方法的效率低、成本高,但比較穩(wěn)定,周期短。二是體細(xì)胞克隆法,以任何方式(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)、電轉(zhuǎn)、病毒轉(zhuǎn)等)將基因轉(zhuǎn)入體細(xì)胞,再通過體細(xì)胞克隆得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,該方法的技術(shù)特點(diǎn)是轉(zhuǎn)導(dǎo)的DNA片段大小有限,效率低,成本遠(yuǎn)比顯微注射法高,陽性率高,原代個(gè)體常有生理異常出現(xiàn)。三是嵌合體法,包括胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ips),其中胚胎干細(xì)胞方法在小鼠上應(yīng)用比較成熟、穩(wěn)定、應(yīng)用廣泛,而ips方法雖已有成功的案例,但不穩(wěn)定。嵌合體法在家畜上目前還處于研究階段,主要原因是建立家畜胚胎干細(xì)胞系很困難,這一方法的技術(shù)特點(diǎn)是原代為嵌合體,只有當(dāng)生殖嵌合時(shí),后代才能獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。四是精子載體,包括DNA或病毒與精子孵育、精子與DNA共注射、睪丸及附睪注射DNA、精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)等,再通過受精產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,該方法的技術(shù)特點(diǎn)是操作簡單、成本低、大片段DNA無效、轉(zhuǎn)基因的效率不穩(wěn)定。五是逆轉(zhuǎn)錄病毒法也稱反轉(zhuǎn)錄病毒法,用包裝好的帶目的基因的缺陷病毒感染胚胎、精子、個(gè)體、胚胎注射等,從而生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,這一方法的技術(shù)特點(diǎn)是轉(zhuǎn)基因效率高、不適于大片段的目的基因,病毒DNA片段的安全隱患難以徹底消除。分析公開的多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,多數(shù)是采用顯微注射、體細(xì)胞克隆或嵌合體方法,相比之下,精子載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒法研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的文獻(xiàn)較多,但生產(chǎn)出能夠穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不多[2,10]。

        5 檢測手段

        轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的檢測一般包括可視化識(shí)別、DNA整合、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯、功能分析等檢測,即感官、分子細(xì)胞和功能3個(gè)水平的檢測[11]。

        5.1 感官水平即可視化識(shí)別

        在對(duì)目的基因表達(dá)載體設(shè)計(jì)時(shí),常采用可以直觀分辨轉(zhuǎn)基因個(gè)體的元素,常用的有毛色、膚色、發(fā)光、藥物刺激表象、動(dòng)作特征等。如能夠表達(dá)黑色標(biāo)記的個(gè)體,在白色群體中黑色個(gè)體為陽性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物;帶有熒光(GFP、RFP等)標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因個(gè)體,在激發(fā)光刺激下會(huì)發(fā)出相應(yīng)的熒光等;而藥物刺激表象、動(dòng)作特征類型的僅有轉(zhuǎn)基因鼠個(gè)體出世,這類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物檢測比較容易,不需要試劑、藥品和專門的儀器設(shè)備,幼仔一出世就能很快鑒別,只是構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)需要設(shè)計(jì)特別的標(biāo)記基因。在嵌合體轉(zhuǎn)基因方面,作為一種特殊的標(biāo)記,膚色標(biāo)記比較實(shí)用,如借助于轉(zhuǎn)基因ips細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等手段制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究中,使用黑色及棕色皮膚標(biāo)記,小動(dòng)物出世后,皮膚上有黑色或棕色斑塊,即為嵌合體轉(zhuǎn)基因個(gè)體,再通過繁殖后代,將得到純黑色或棕色的轉(zhuǎn)基因個(gè)體。這方面成功的例子實(shí)驗(yàn)鼠比較多。

        5.2 分子水平檢測

        包含DNA、RNA和蛋白質(zhì)。其中DNA檢測主要指整合檢測,可用PCR初步判斷,再用DNA印記雜交(Southern blot)確定,還可以結(jié)合其他檢測,如斑點(diǎn)雜交(Dot blot)和原位雜交等加以判斷;RNA和蛋白檢測屬于表達(dá)檢測,RNA分析可用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)初步檢測,RNA印記雜交(Northern blot)定性,RT-PCR結(jié)合定量PCR定量;蛋白質(zhì)初步判斷用瓊脂擴(kuò)散、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)等,定性以蛋白質(zhì)印記雜交(Western blot)為基準(zhǔn)加以判斷,免疫組化、放射免疫等可以作為參考。

        5.3 功能水平檢測

        這部分檢測比較復(fù)雜,不同的基因檢測手段各不相同,沒有參考和比較的價(jià)值,如異種器官移植的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物功能檢測就是直接用血清灌注器官研究其反應(yīng),細(xì)胞毒試驗(yàn)直接用異原血清攻擊細(xì)胞研究細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,抗病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物直接用病毒攻擊探索其抗病的能力等。因此,功能水平檢測是檢驗(yàn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的最后一關(guān),一旦達(dá)到預(yù)期的功能——家畜生長快、異種器官能抵御排斥、反應(yīng)器生產(chǎn)的藥物能治療疾病、帕金森病醫(yī)學(xué)模型出現(xiàn)癥狀等,這才是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究實(shí)質(zhì)性成功的標(biāo)志。

        6 繁殖傳代

        轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中,有些動(dòng)物是可以繁殖傳代的,這說明外源的DNA整合到基因組中,同時(shí)也證明該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物繁殖機(jī)能正常,只有這樣轉(zhuǎn)基因動(dòng)物才能進(jìn)行育種。有些必須通過傳代才能得到真正意義上的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,如嵌合體法得到的動(dòng)物只能在后代中篩選整合外源基因的個(gè)體。特殊情況下,繁殖傳代不一定是必需的,如逆轉(zhuǎn)錄病毒感染胎鼠,只研究轉(zhuǎn)基因后的結(jié)果,不關(guān)心傳代問題[12,13]。

        綜上所述,不難看出,研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物不只是簡單把基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物的基因組中,而是要綜合考慮,從研究的目的、載體、動(dòng)物、方法到檢測、傳代每個(gè)環(huán)節(jié)都需要仔細(xì)斟酌,建立適合研究者所需的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)路線,才能達(dá)到預(yù)期的研究目的。

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        收稿日期:2012-03-26

        基金項(xiàng)目:轉(zhuǎn)基因生物新品種培育專項(xiàng)(2011ZX08006-003、-002);湖北省農(nóng)業(yè)創(chuàng)新項(xiàng)目畜牧獸醫(yī)分項(xiàng)(2011-620-001-003);重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放

        課題(2012ZD164)

        作者簡介:劉西梅(1963-),女,陜西浦城人,副研究員,主要從事動(dòng)物生物技術(shù)研究,(電話)027-87380647(電子信箱)anbit20@163.com。

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