摘要：利用亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、沙門氏-志賀氏屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）、科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基、Reveal沙門氏菌檢測(cè)試劑盒和分子生物學(xué)方法對(duì)不同動(dòng)物的糞便樣本進(jìn)行沙門氏菌（Salmonella）的分離和鑒定。采用微量肉湯稀釋法對(duì)分離菌株進(jìn)行恩諾沙星、安普霉素和氟苯尼考等17種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Whonet5.4軟件統(tǒng)計(jì)以比較不同來源沙門氏菌的分離率和耐藥譜型差異。結(jié)果表明，不同動(dòng)物來源沙門氏菌的分離率和耐藥譜型差異較大，其中牦牛源沙門氏菌的分離率和耐藥率最低，禽源和犬源沙門氏菌的分離率差別不大，但耐藥譜型差異較大。

關(guān)鍵詞：沙門氏菌（Salmonella）；分離鑒定；耐藥譜型

中圖分類號(hào)：S852.61 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2012）21-4834-03

Isolation， Identification and Drug Resistance Spectrum Comparison of Salmonella from Different Sources

CHEN Chao-xi1，DU Xiong-wei2，SHI Zhi-hai3

（1. College of Life Science and Technology， Southwest University for Nationalities， Chengdu 610041，China；

2. College of Life Science and Technology， Dalian Nationalities University， Dalian 116600， Liaoning，China；

3. Insititute of Animal Husbandry and Veterinary Research， Henan Academy of Agricultural Science， Zhengzhou 450002，China）

Abstract： The Salmonella from manure samples of different animals were isolated and identified by use of selenite cystine enrichment broth（SC）， Salmonella-shigella agar（SS）， CHROM agar Salmonella colored medium， the Reveal Salmonella detection kit and molecular biological method. Microdilution broth method and Whonet5.4 software were used for antimicrobial susceptibility testing of the isolated strain to Enrofloxacin， Apramycin， Florfenicol and other 14 kinds of antimicrobial agents and the analysis on the isolation rates and drug resistance spectum in different sources of Salmonella. The results showed that there existed apparent differences in Salmonella isolation rates and drug resistance patterns from different animal origins. The isolation rate and drug resistance rate in Yak origin Salmonella were the lowest. The isolation rate between the Salmonella in avian and canine origin had no significant difference， but the drug resistance spectrum showed significant difference.

Key words： Salmonella； isolation and identification； drug resistance spectrum

沙門氏菌（Salmonella）是一種重要的人畜共患病原菌，其耐藥性問題日益嚴(yán)重，在抗生素持續(xù)壓力下甚至發(fā)生變異，以適應(yīng)藥物的壓力環(huán)境，從而對(duì)人類的身體健康和畜牧業(yè)的持續(xù)發(fā)展造成嚴(yán)重危害。劉琴等[1]研究表明，沙門氏菌污染在一定程度上是由于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的衛(wèi)生不良所致。張秀英等[2]的報(bào)道也表明，分離的沙門氏菌對(duì)鏈霉素的耐藥率達(dá)到50.0%以上。在法國(guó)，47%（118/252）患有低丙種球蛋白血癥的慢性或反復(fù)發(fā)作的腹瀉病人對(duì)賈第鞭毛蟲、彎曲桿菌屬和沙門氏菌更加脆弱易感[3]。本研究主要對(duì)不同動(dòng)物的糞便樣本進(jìn)行采集，利用SC增菌液、SS瓊脂、Reveal沙門氏菌檢測(cè)試劑盒和科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，同時(shí)采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行沙門氏菌毒力相關(guān)標(biāo)志基因invE檢測(cè)，并對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，確定其對(duì)抗菌藥物的敏感性，比較不同動(dòng)物來源沙門氏菌的耐藥譜型差異。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：53株沙門氏菌從2009年9月至2011年6月采集的不同動(dòng)物（牦牛、禽類和犬）的699份糞便樣本中分離，大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25922由西南民族大學(xué)獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基，抗菌藥物，生化試劑：亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、沙門氏-志賀氏屬瓊脂培養(yǎng)基（SS）和腸桿菌科生化編碼管購自成都培能醫(yī)療科技有限公司，科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基購自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司，Reveal沙門氏菌檢測(cè)試劑盒和分子生物學(xué)試劑購自寶生物工程（大連）有限公司。阿莫西林（Amo）、卡那霉素（Kan）、阿米卡星（Amk）、慶大霉素（Gen）、多西環(huán)素（Dox）、恩諾沙星（Enr）、左旋氧氟沙星（Lev）、利福平（Rif）、氟苯尼考（Flo）、多粘菌素（Pmb）、頭孢曲松（Cro）、頭孢噻肟（Ctx）、安普霉素（Apr）、磺胺嘧啶鈉（SD-Na）、土霉素（Otc）、鏈霉素（Str）和頭孢噻呋鈉（Cef）等17種抗菌藥物由成都中牧生物藥業(yè)有限公司饋贈(zèng)。invE引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2 方法

按照常規(guī)方法對(duì)不同動(dòng)物的糞便進(jìn)行樣本采集和處理，針對(duì)沙門氏菌分離難度較大的實(shí)際特點(diǎn)，本研究采用以下步驟進(jìn)行。

1.2.1 SC增菌液增菌 用滅菌棉簽蘸取經(jīng)處理的糞便樣本，放入加了6 mL SC增菌液的10 mL試管中，37 ℃培養(yǎng)16～24 h。

1.2.2 SS瓊脂分離培養(yǎng) 用接種環(huán)將可疑樣本接種至SS瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。

1.2.3 科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng) 根據(jù)菌落在SS瓊脂上的生長(zhǎng)情況，在不同時(shí)間點(diǎn)分別挑取單菌落在科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)時(shí)間維持24～48 h，進(jìn)一步分離和純化沙門氏菌。

1.2.4 生化鑒定 對(duì)科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上陽性和可疑陽性的菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)后，按照腸桿菌科生化鑒定編碼管的說明進(jìn)行生化鑒定。

1.2.5 Reveal沙門氏菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè) 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，主要步驟包括試劑的配制、沙門氏菌的增菌培養(yǎng)、試紙條測(cè)試和結(jié)果判讀幾個(gè)步驟。需要注意的是，各培養(yǎng)基的溶解過程中對(duì)溫度的要求不同，應(yīng)嚴(yán)格按要求操作。

1.2.6 分子生物學(xué)鑒定 純化好的沙門氏菌增菌培養(yǎng)后進(jìn)行DNA抽提，利用Prmier5.0設(shè)計(jì)相應(yīng)invE引物[invE-F：TTTCCTGACCCCAGTGAT， invE-R： A（G/A）CGATAATGTTTTCCCAA]，按照以下程序進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增（94 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min），預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為186 bp。

1.2.7 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)及耐藥譜型分析 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（National Committee for Clinical Laboratory Stands，NCCLS）推薦的微量肉湯稀釋法操作步驟進(jìn)行[4]。利用Whonet5.4軟件對(duì)17種抗菌藥物進(jìn)行耐藥水平分析，比較不同動(dòng)物來源菌株的耐藥譜型差異。

2 結(jié)果

2.1 不同動(dòng)物來源沙門氏菌的分離鑒定結(jié)果

試驗(yàn)采用SC增菌液對(duì)沙門氏菌進(jìn)行培養(yǎng)，能夠抑制其他腸道菌的過度生長(zhǎng)。在SS瓊脂平板上大多數(shù)沙門氏菌為無色、透明菌落，部分菌株在菌落中央呈黑色或黑褐色。對(duì)SS上的可疑菌株同時(shí)采用沙門氏菌檢測(cè)試劑盒檢測(cè)、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)和分子生物學(xué)鑒定，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基上沙門氏菌為紫色或者淡紫色菌落，而沙門氏菌檢測(cè)試劑盒的陽性結(jié)果表現(xiàn)為試紙條的測(cè)試區(qū)有線性條紋，沙門氏菌毒力相關(guān)標(biāo)志基因invE檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，除第九泳道在SS上的可疑菌落經(jīng)PCR檢測(cè)為陽性外，其他在SS上生長(zhǎng)可疑的菌落經(jīng)PCR檢測(cè)均表現(xiàn)陰性。

從采集的699份糞便樣本中共分離到沙門氏菌53株，其中牦牛源12株，禽源24株，犬源17株，分離率分別為5.19%、9.06%和8.37%，牦牛源沙門氏菌的分離率最低，而禽源和犬源沙門氏菌的分離率差別不大（表1）。

2.2 不同動(dòng)物來源沙門氏菌的耐藥譜型分析

利用Whonet5.4軟件分別對(duì)不同動(dòng)物來源的沙門氏菌進(jìn)行不同藥物MIC50、MIC90和MIC范圍的計(jì)算，分析其耐藥譜型的差異。結(jié)果（表2）表明53株沙門氏菌中共有3株對(duì)試驗(yàn)藥物均敏感，其中牦牛源2株，犬源1株，其余菌株對(duì)多粘菌素、阿米卡星和慶大霉素均敏感，對(duì)土霉素和鏈霉素均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性。10株牦牛源沙門氏菌共有4種不同耐藥譜型表型，各表型菌株的數(shù)量差別不大；24株禽源沙門氏菌共有11種耐藥譜型，至少對(duì)3種以上的抗菌藥物耐藥；16株犬源沙門氏菌共有7種耐藥譜型，至少對(duì)4種以上的抗菌藥物耐藥。

3 小結(jié)與討論

3.1 沙門氏菌的分離鑒定

本研究利用亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、沙門氏-志賀氏屬瓊脂培養(yǎng)基、Reveal沙門氏菌檢測(cè)試劑盒、科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和分子生物學(xué)方法等對(duì)沙門氏菌進(jìn)行分離鑒定。其中有以下幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：（1）SC增菌液：在增菌中，SC培養(yǎng)液的添加量越大，對(duì)沙門氏菌的分離越有益，因?yàn)镾C能有效地抑制糞便中其他腸道菌（包括革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌）的過度增長(zhǎng)。（2）SS瓊脂：在劃線接種過程中，大多數(shù)沙門氏菌在瓊脂板上為無色透明的菌落，部分菌落的頂部有黑色斑點(diǎn)，但是試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)有黑色斑點(diǎn)的菌落經(jīng)PCR檢測(cè)出現(xiàn)陰性結(jié)果。（3）Reveal沙門氏菌檢測(cè)試劑盒：該方法快速準(zhǔn)確，但需要注意的是在結(jié)果判讀時(shí)必須保證對(duì)照區(qū)有線條，同時(shí)不論測(cè)試區(qū)的線條密集程度如何，只要顯示線條就判定為陽性結(jié)果。（4）科瑪嘉顯色培養(yǎng)基：沙門氏菌在該培養(yǎng)基上主要生長(zhǎng)為紫色菌落，如果部分菌株在24 h內(nèi)沒有紫色或者淡紫色菌落生長(zhǎng)，應(yīng)適當(dāng)增加培養(yǎng)時(shí)間至48 h。（5）分子生物學(xué)方法：本試驗(yàn)采用分子生物學(xué)方法對(duì)沙門氏菌毒力相關(guān)標(biāo)志基因invE進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合其他培養(yǎng)基和試劑盒的使用，能夠保證沙門氏菌的準(zhǔn)確分離和鑒定。

3.2 沙門氏菌的分離率和耐藥性分析

本試驗(yàn)對(duì)不同動(dòng)物的699份糞便樣本進(jìn)行分離，共分離到沙門氏菌53株，分離率為7.58%，其中牦牛源、禽源、犬源的分離率分別為5.19%、9.06%和8.37%。與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究相比，其分離率除了比宋立等[5]的報(bào)道高外，均低于其他相關(guān)報(bào)道[1，6，7]。

本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，53株分離菌中，除了2株牦牛源、1株犬源沙門氏菌對(duì)試驗(yàn)藥物全部敏感外，其余分離菌株對(duì)土霉素和鏈霉素均表現(xiàn)出耐藥，而且除牦牛源沙門氏菌的耐藥水平較低外，禽源和犬源的耐藥譜型大多數(shù)超過4種抗菌藥物。國(guó)外相關(guān)研究也表明，分離的沙門氏菌至少對(duì)一種以上的抗生素耐藥，而且大多數(shù)菌株表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象[8，9]。這些提示我們，在獸醫(yī)臨床中沙門氏菌已呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，我們的后期工作是對(duì)分離的敏感株進(jìn)行不同藥物的誘導(dǎo)，研究在不同抗菌藥物壓力下沙門氏菌的耐藥水平和耐藥譜型的變化規(guī)律，以及在不同誘導(dǎo)壓力下，沙門氏菌生物被膜形成能力及相關(guān)毒力基因和耐藥基因之間的相互關(guān)系，闡述不同因素之間的相關(guān)性。

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收稿日期：2012-03-15

基金項(xiàng)目：西南民族大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金學(xué)術(shù)梯隊(duì)建設(shè)工程項(xiàng)目（11NZYTD02）

作者簡(jiǎn)介：陳朝喜（1980-），男，河南唐河人，講師，博士，主要從事獸藥殘留檢測(cè)及細(xì)菌耐藥機(jī)制研究，（電話）13980060375（電子信箱）

chaoxi8832@163.com。