摘要：以湖北省地方特色柑橘桃葉橙為研究對象，開展了資源調(diào)查、搜集及評價工作。從品質(zhì)分析角度闡述了當前桃葉橙已經(jīng)成為一個品種群體，果實大小、種子數(shù)量和可溶性固形物含量等性狀變化較大，影響了桃葉橙的鮮食品質(zhì)，不利于桃葉橙產(chǎn)業(yè)未來的發(fā)展。通過測定并從中優(yōu)選了24份單株資源，并針對育種目標進行了資源分類，為桃葉橙選育工作奠定基礎。AFLP分子鑒定從DNA水平充分證明了參試樣品發(fā)生了遺傳物質(zhì)的變異，同時也初步探明了各單株與桃葉橙8號、18號和139號的遺傳進化關(guān)系。

關(guān)鍵詞：桃葉橙；資源；評價；鑒定

中圖分類號：S666.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4823-04

Diversity Assessment of Taoye Orange （Citrus sinensis （Linn.） Osbeck cv. Taoye Cheng） Germplasm Resources and Molecular Characterization Using AFLP Markers

HE Li-gang1，JIANG Ying-chun1，WU Li-ming1，XU Miao1，TONG Zhu1，WANG Zhi-jing1，SUN Zhong-hai1，

WU Shu-yong2，CUI Xu-dong3

（1. Institute of Fruit and Tea， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430209，China；

2. Local Specialty Service Center in Zigui County， Yichang 443600，China；

3. Production and Marketing Professional Cooperatives for Taoyecheng Orange in Quyuan Town of Zigui County，Yichang 443604，Hubei，China）

Abstract： Taking taoye orange as the research object， evaluation analysis on fruit quality showed that the range of fruit size， seed number and content of total soluble solid altered widely in Taoye orange， reduced the fresh food quality and contributed negatively to the development of Taoye orange industry. In addition， 24 germplasm resources were selected as candidates and classified into five classes for future selection according to breeding objectives. The results of AFLP analysis revealed the relationship between individual and No. 8， No. 18， or No. 139， and suggested that a genetic variation had happened definitely in selected germplasm resources.

Key words： Taoye orange； germplasm； diversity assessment； AFLP

桃葉橙原產(chǎn)于湖北省秭歸縣屈原鎮(zhèn)龍馬溪村低山地，由于其春梢葉片呈披針形，狹長似桃葉，故命名為桃葉橙。自20世紀60年代開始，湖北省農(nóng)業(yè)科學院果樹茶葉研究所就已開展了桃葉橙的相關(guān)研究工作。典型桃葉橙果實果形端正，果面橙紅光滑，臍部有印圈，果肉橙黃，皮薄子少，濃甜質(zhì)脆，汁多化渣，富玫瑰香氣，具有甜、香、脆的獨特風味，鮮食品質(zhì)極佳[1]。由于其品質(zhì)的優(yōu)越性，桃葉橙與臍橙、夏橙并譽為“峽橙三秀”，曾是中國柑橘三大地方良種之一。

20世紀80年代，桃葉橙是秭歸縣重點推廣和發(fā)展的柑橘良種，在秭歸縣境內(nèi)各柑橘產(chǎn)區(qū)廣泛栽培。然而，20世紀90年代臍橙引種成功，導致桃葉橙種植面積逐漸萎縮；同時，由于三峽庫區(qū)蓄水工程的順利推進，原有桃葉橙優(yōu)良單株和桃葉橙豐產(chǎn)園均被淹沒。其次，原產(chǎn)地栽培品種混雜，管理措施相對落后，影響了桃葉橙原有優(yōu)良品質(zhì)的發(fā)揮，導致果實大小參差不齊，種子偏多，品質(zhì)下降，嚴重阻礙了桃葉橙商品化的生產(chǎn)[2，3]。因此，桃葉橙在市場競爭中處于劣勢，受市場影響原產(chǎn)地農(nóng)戶也出現(xiàn)拋棄桃葉橙改種臍橙的現(xiàn)象，一定程度上更加速了桃葉橙種植面積的下滑和桃葉橙產(chǎn)業(yè)的衰落?；谔胰~橙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展現(xiàn)狀，擬通過對搜集到的桃葉橙群體資源進行品質(zhì)測定，并進行綜合評價分析，以篩選出果大、少核或無核和高糖低酸的候選單株，輔以AFLP分子標記技術(shù)進行遺傳變異鑒定，從基因水平進一步確定桃葉橙優(yōu)變單株，從而充分發(fā)揮桃葉橙特色資源優(yōu)勢和文化優(yōu)勢，為桃葉橙提純選優(yōu)、新品種選育及桃葉橙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2009年和2010年連續(xù)兩年在秭歸縣屈原鎮(zhèn)廣泛開展桃葉橙資源調(diào)查，單株編號，并采集樹體中上部不同方位果實15個以上，待測。針對2009年和2010年入選復選的優(yōu)良單株，依據(jù)編號隨機采集樹體外圍無病蟲危害的幼嫩葉片，液氮速凍后

-80 ℃保存用于AFLP分子鑒定。

1.2 品質(zhì)測定

稱取15個以上果實，計算單果重；分別用直尺一次性量取15個以上果實縱徑和橫徑，計算果形指數(shù)；描述果實色澤（橙紅、橙黃、黃）和香氣有無；一次性切取5個以上果實，描述風味（甜酸、適中、酸甜）；測定5個果實赤道面皮厚，計算單果皮厚，并統(tǒng)計種子數(shù)量；采用糖度數(shù)顯折射儀DRB0-45 （購自上海測維光電技術(shù)有限公司）測定果實可溶性固形物含量；可滴定酸含量測定采用酚酞指示劑法，VC含量測定采用2，6-二氯靛酚滴定法[4]。

1.3 DNA的提取

桃葉橙葉片基因組DNA提取采用改良CTAB法[5]。最后用30～50 μL TE緩沖液溶解沉淀，并于0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測。

1.4 AFLP分析

AFLP分析中所采用的引物及接頭序列見表1，其中E 和M 分別表示EcoRⅠ系列引物和MseⅠ系列引物，具體操作流程參考文獻[6]。酶切連接反應體系為25 μL，DNA底物為200 ng，EcoRⅠ和MseⅠ各2 μL，接頭1 μL，10 mmol/L ATP 2.5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，瞬時離心混合后37 ℃溫育5 h，8 ℃繼續(xù)保溫4 h，4 ℃過夜。預擴增采用25 μL反應體系，DNA模板2 μL，預擴增引物1 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq聚合酶0.5 μL，瞬時離心數(shù)秒，擴增參數(shù)：94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，30個循環(huán)。預擴增產(chǎn)物采用TE稀釋20倍，取2 μL作為選擇性擴增模板，選擇性擴增引物1 μL，dNTPs 0.5 μL，Taq聚合酶0.5 μL，加入ddH2O至25 μL，瞬時離心數(shù)秒混勻，第一輪擴增參數(shù)：94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7 ℃，12個循環(huán)；第二輪參數(shù)：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，23個循環(huán)。擴增產(chǎn)物加入10 μL Loading Buffer 混勻，95 ℃變性，4%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.5 數(shù)據(jù)處理

品質(zhì)測定結(jié)果導入Excel軟件中，計算單果重、果形指數(shù)、皮厚以及可滴定酸和VC含量，采用SAS 9.2軟件對計算結(jié)果進行標準差和變異系數(shù)的統(tǒng)計分析。AFLP分析中獲得的DNA譜帶進行數(shù)字化統(tǒng)計，有帶的位置計為1，無帶的位置計為0，將統(tǒng)計結(jié)果輸入Excel表格中，利用NTSYS pc 2.10e數(shù)據(jù)分析軟件進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃葉橙資源評價

2009年和2010年分別測定29份和44份桃葉橙單株果實樣品。室內(nèi)測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桃葉橙果實色澤橙紅，普遍具有香氣，風味酸甜為主，汁多化渣。表2和表3統(tǒng)計分析結(jié)果表明，桃葉橙果實單果重89.00～205.40 g，變異系數(shù)2009、2010年分別為14.56%、14.99%，性狀表現(xiàn)參差不齊；種子數(shù)變化大，變化范圍0.70～15.70粒，變異系數(shù)2009年、2010年分別為39.87%、53.47%，極不穩(wěn)定，影響鮮食品質(zhì)；可溶性固形物含量變化相對較小，最低11%，最高可達14%，變異系數(shù)2009、2010年分別為6.28%、4.67%；可滴定酸含量也有較大幅度變化，變異系數(shù)2010年達40.36%；此外，果皮厚度變異也比較嚴重。根據(jù)大果、少核或無核和高糖等選育目標，2009年7份、2010年17份入選復選（表3、表4），并初步確定WGH-01、DYL-63和WSF-40作為重點候選優(yōu)株，進入優(yōu)良性狀遺傳穩(wěn)定性觀察階段。為儲備桃葉橙特色育種資源，對入選優(yōu)株進行資源分類，結(jié)果見表5。

2.2 AFLP聚類分析

對2009～2010年參選的桃葉橙資源中的23份單株進行AFLP分子鑒定發(fā)現(xiàn)，64對通用引物中引物對E-ACT/M-CAA、E-ACT/M-CTT、E-ACC/M-CAA、E-ACG/M-CAA、E-AGC/M-CAA和E-AGC/M-CAC能夠?qū)⒋蟛糠謽悠穮^(qū)別開。其中，以桃葉橙雜交父本金水柑為外部對照，桃葉橙各單株（包括雜交親本及子代）在相似系數(shù)為0.28～0.67水平上聚類（圖1），3株桃葉橙候選優(yōu)株中，WSF-40和DYL-63與18號較為臨近，與8號相距較遠，說明WSF-40和DYL-63可能為18號營養(yǎng)系后代；WGH-01為139號營養(yǎng)系后代，與18號、8號差別均比較明顯，聚類分析充分證明了這一觀點。

3 小結(jié)

以柑橘地方特色品種秭歸桃葉橙作為研究對象，旨在為重振桃葉橙產(chǎn)業(yè)奠定理論基礎。桃葉橙在原產(chǎn)地具有深厚的群眾基礎和文化底蘊，在市場經(jīng)濟飛速發(fā)展的今天，充分挖掘和利用資源優(yōu)勢，有利于桃葉橙產(chǎn)業(yè)的復蘇和壯大。擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的品種是市場競爭的核心，發(fā)展桃葉橙產(chǎn)業(yè)必須具有性狀優(yōu)良的桃葉橙品種（系），針對這一目標，開展了廣泛的資源調(diào)查、搜集及評價工作，并且初步確定桃葉橙品種（系）候選優(yōu)株，然而由于桃葉橙目前在原產(chǎn)地栽培環(huán)境復雜，多為小范圍種植，資源搜集難度較大，群體的覆蓋率難以保證；其次，大多數(shù)單株資源僅采用一年的試驗數(shù)據(jù)，其遺傳穩(wěn)定性還有待連續(xù)的觀察和研究。

AFLP分子鑒定分析中，雖然將大部分樣品區(qū)別開，但是對于桃葉橙8號、18號和139號的進化關(guān)系仍不明確，根據(jù)記載，18號來源于8號，聚類分析圖中可以說明這一點，然而139號為18號的營養(yǎng)系后代，聚類分析沒有反映這一點，這可能與分子鑒定過程中篩選的引物數(shù)量有關(guān)，由于僅采用了6對引物，無法覆蓋全部基因組，不能客觀反映基因組序列中所有的差異位點，通過增加篩選引物組合數(shù)量可以緩解。

參考文獻：

[1] 向長海.秭歸開展桃葉橙優(yōu)良單株選育[J].中國果業(yè)信息，2009，26（12）：44.

[2] 孫林紅，王耀群，吳述勇，等.桃葉橙豐產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)措施[J]. 柑桔與亞熱帶果樹信息，2001，17（2）：22-23.

[3] 向長海，周志虎，戈 偉，等.一代名品“桃葉橙”的發(fā)展現(xiàn)狀與振興對策[J].現(xiàn)代園藝，2008（9）：49-51.

[4] 李錫香. 新鮮果蔬的品質(zhì)及其分析法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1994.

[5] 許 淼，蔣迎春，孫中海，等.鄂柑一號椪柑少核芽變的AFLP分析[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2011，50（17）：3556-3559.

[6] 周延清. DNA分子標記技術(shù)在植物研究中的應用[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005.

收稿日期：2012-03-16

基金項目：湖北省研究與開發(fā)項目（2011BBB049）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項目（2007-620-001-03）；湖北省農(nóng)科院果茶所青年科學基金

項目（GCJJ201203）

作者簡介：何利剛（1982-），男，湖北羅田人，助理研究員，博士，主要從事果樹生物技術(shù)育種和抗寒分子機理研究，（電話）027-87988653

（電子信箱）lghe44@yahoo.com.cn；通訊作者，蔣迎春，研究員，（電話）027-87989513（電子信箱）jyc6512@yahoo.com.cn。