摘要：根據(jù)引物篩選結(jié)果，選出9個均可用SSR引物RM17檢測純度的兩系雜交稻品種，通過室內(nèi)鑒定判斷品種間的分子學(xué)差異。同時通過田間正季鑒定判斷品種間的植物學(xué)特征差異，探討SSR引物的分辨力和可靠性。結(jié)果表明，當(dāng)遺傳背景較近的品種相互混雜時，用單對引物不能有效區(qū)分。

關(guān)鍵詞：兩系雜交稻；SSR；不同品種；同一引物；純度鑒定；比對

中圖分類號：S511；Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2012）21-4720-02

Study on Detection of Seed Purity of Two-line Hybrid Rice by Simple Sequence Repeat （SSR）Ⅳ. Experiments of Detecting Different Varieties by Same Primer

ZHAO Hong1，ZHANG Yu-fei1，LIN Mei1，LIAO Fang-li1，XIONG Xian-feng1，TU Shu-xin2，ZHANG Kai3

（1.Seed Administration Bureau of Jingzhou，Jingzhou 434020，Hubei，China；2. Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；

3.College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract： According to primer sorting results， seeds of 9 two-line hybrid rice varieties of which the purity could be detected by SSR marker RM17 were chosen to identify their molecular differences by laboratory tests. At the same time， the discretion and dependability of SSR methods was evaluated by the morphological and biological differences in the field. It was concluded that varieties with similar genetic background could not be distinguished by only one pair of primer.

Key words： two-line hybrid seeds； different varieties； one pair of primer； purity identity； alignment

利用SSR分子標(biāo)記鑒定兩系雜交稻種子純度，具有快速、穩(wěn)定、重復(fù)性好、多態(tài)性明顯的優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)在室內(nèi)鑒定種子純度應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記方法。該方法一般是從大量的引物中篩選出多態(tài)性高、共顯性強(qiáng)，雙親譜帶清晰的1對引物，然后用這1對引物來鑒定雜交稻種子的純度[1-7]。但是往往1對引物對多個品種都具有多態(tài)性，且符合引物篩選的標(biāo)準(zhǔn)，就意味著1對引物可用于多個品種的純度鑒定，這為篩選引物和鑒定品種提供了方便?？墒侨绻@些品種之間發(fā)生了混雜，用目前的方法是否也能發(fā)現(xiàn)并得到準(zhǔn)確的純度鑒定結(jié)果卻鮮見報道[1，8，9]。為了探討同一引物對不同品種間混雜株的分辨率，判斷單對SSR引物測定兩系雜交稻種子純度的準(zhǔn)確性和可靠性，特開展此試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)共用9個雜交稻品種做材料，其中天兩優(yōu)616、兩優(yōu)17、苯兩優(yōu)639 三個品種由湖北省種子管理局提供；豐兩優(yōu)香1號、荊兩優(yōu)10號、深兩優(yōu)5814、兩優(yōu)6326、Y兩優(yōu)1號、揚(yáng)兩優(yōu)6號6個品種由荊州市種子管理局從市場上抽取商品種子，并經(jīng)生產(chǎn)企業(yè)確認(rèn)。

所用引物及試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。

1.2 DNA模板制備和引物選擇

DNA模板的制備：每個品種從田間抽取10株標(biāo)準(zhǔn)單株，用農(nóng)業(yè)部推薦的簡易法提取DNA，用這10株單株的混合DNA作為模板進(jìn)行鑒定。

引物選擇：選取在兩系雜交種純度檢測時使用頻率較高，且上述9個品種均可使用的RM17作為檢測引物。

1.3 PCR反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積10 μL ：10×buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，50 ng/μL primer 0.2 μL+0.2 μL，2U/μL Taq 酶 0.6 μL，25 ng/μL DNA 1 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min； 94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃下延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為3%、含EB的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

1.4 田間正季鑒定

田間鑒定于2011年4月15日播種，5月15日移栽。每品種田間種植1個小區(qū)，每小區(qū)種植500株，株行距為16.7 cm×26.7 cm，共10行，每行50株，并設(shè)親本對照。在抽穗前及齊穗后分兩次按GB/T 3543.5—1995進(jìn)行田間純度鑒定，并觀察比較各品種間的植物學(xué)特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 各品種純度的SSR鑒定結(jié)果

在同一條件下，利用SSR引物RM17對豐兩優(yōu)香1號、荊兩優(yōu)10號、深兩優(yōu)5814、兩優(yōu)6326、Y兩優(yōu)1號、天兩優(yōu)616、兩優(yōu)17、苯兩優(yōu)639和揚(yáng)兩優(yōu)6號9個兩系雜交稻品種進(jìn)行室內(nèi)純度的分子學(xué)檢測。結(jié)果表明，9個品種室內(nèi)SSR引物鑒定譜帶特征一致，瓊脂糖電泳不能區(qū)別互相混雜的雜株類型（圖1）。由圖1可知，9個品種電泳后，都呈現(xiàn)出兩條清晰明亮的雙親互補(bǔ)帶，說明該引物能夠應(yīng)用于這些品種的室內(nèi)鑒定。但在相同的電泳時間內(nèi)，用DL600 DNA Marker對比這些譜帶，發(fā)現(xiàn)這9個品種的譜帶在凝膠上的位置都在一條線上，分子量大小相當(dāng)，用現(xiàn)行的室內(nèi)鑒定方法無法區(qū)分出品種間的差異。

2.2 各品種純度的田間鑒定結(jié)果

9個品種田間種植鑒定植物學(xué)特征差異較大，易于區(qū)分品種間混雜的雜株類型（表1）。根據(jù)調(diào)查的特征特性的差異將受檢品種分成6類進(jìn)行田間鑒定：①兩優(yōu)17是早稻品種，可通過株高和生育期分辨；②深兩優(yōu)5814和Y兩優(yōu)1號可通過株型、劍葉葉型、葉位和穗部著粒密度辨別；③揚(yáng)兩優(yōu)6號和荊兩優(yōu)10號的生育期最長，是其識別標(biāo)志；④兩優(yōu)6326的株型和整齊度較特殊；⑤其他3個品種中，苯兩優(yōu)639可通過株高和生育期辨別，天兩優(yōu)616系一季晚稻品種，生育期短，植株較矮，可與豐兩優(yōu)香1號相區(qū)分。以上結(jié)果說明在同一栽培管理?xiàng)l件下，9個品種間都存在不同程度的差異，可在田間加以區(qū)分。

3 小結(jié)與討論

9個不同品種的田間植株植物學(xué)特征差異較大，但瓊脂糖凝膠電泳的譜帶完全一致。一方面說明該引物擴(kuò)增的這些序列片段分子量差異小甚至相同；另一方面說明了瓊脂糖凝膠對SSR擴(kuò)增片段的分辨率不高，不足以區(qū)分不同品種譜帶間的差異。

目前室內(nèi)純度鑒定通常使用的引物可能都不是相應(yīng)品種的特異引物，這極易造成在鑒定遺傳背景相近的同質(zhì)化品種時出現(xiàn)誤判，使室內(nèi)結(jié)果和田間結(jié)果之間產(chǎn)生誤差。如果混雜的雜株是兩個親緣相近但田間特征特性表現(xiàn)差異的品種，用本試驗(yàn)采用的SSR標(biāo)記來鑒定種子純度存在極大的風(fēng)險，其結(jié)果也是不可靠的。因此，要使用單對引物來鑒定純度，必須建立DNA指紋數(shù)據(jù)庫，找到每個品種區(qū)別于其他品種的特異SSR片段，以及與之相應(yīng)的特異SSR引物，才能將親緣相近的品種區(qū)分開。

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收稿日期：2012-04-11

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201103007）

作者簡介：趙 虹（1965-），女，湖北天門人，農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)作物種子質(zhì)量檢驗(yàn)及管理工作，（電話）13871189829（電子信箱）

jyjyk502@163.com；通訊作者，張 凱，（電話）0716-8400643（電子信箱）fongyun00@tom.com。