鄒國紅 孫軍祥 蘇正 董麗儒 宋旭東

·論著·

siRNA干擾Gal-3對Eca-109食管癌細(xì)胞株CyclinD1、p21、p27蛋白表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響

鄒國紅 孫軍祥 蘇正 董麗儒 宋旭東

目的探討siRNA干擾Galectin-3 mRNA后，食管癌Eca-109細(xì)胞株增殖活性的影響及Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白的表達(dá)。方法將Galectin-3-siRNA轉(zhuǎn)染食管癌Eca-109細(xì)胞株后，分別用Real-time PCR、MTT、流式細(xì)胞術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)分別檢測轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞周期分布及Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白的表達(dá)。結(jié)果食管癌Eca-109細(xì)胞增殖活性明顯減少，主要分布在G1期，Galectin-3和CyclinD1蛋白表達(dá)下降，p21和p27蛋白的表達(dá)升高。結(jié)論運(yùn)用siRNA可有效抑制Galectin-3蛋白的表達(dá)及細(xì)胞增殖活性，Galectin-3參與食管癌Eca-109細(xì)胞株的增殖與CyclinD1、p21、p27蛋白關(guān)系密切，Galectin-3可成為治療食管癌的靶基因。

Galectin-3;CyclinD1;p21;p27;Real-time PCR、siRNA;食管癌

Galectin-3是Galectin(半乳凝素)家族的重要成員之一，廣泛表達(dá)于正常上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、分化、粘附、凋亡及新生血管形成。研究顯示，Galectin-3與腎癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、肝癌和乳腺癌等多種腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］。本研究采用RNAi技術(shù)，將針對人Galectin-3基因的siRNA轉(zhuǎn)染入Eca-109食管癌細(xì)胞系，觀察Eca-109食管癌細(xì)胞系增殖情況及CyclinD1、p21、p27蛋白的表達(dá)，探討Galectin-3在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Eca-109食管癌細(xì)胞株購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫。Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自 Invitrogen公司，MTT及RPMI-1640培養(yǎng)基購自Sigma公司，PBS、胰酶及胎牛血清購于中科院血研所，Galectin-3、CyclinD1、p21、p27鼠抗人單克隆抗體及免疫細(xì)胞化學(xué)相關(guān)試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。RT-PCR Master Mix及PCR引物購自上海生物工程有限公司。Galectin-3引物序列:上游5-CTGGGCCACTGATTGTGCCTTAT-3，下游 5-TCCTGTTGTTCTCATTGAAGCGTG-3;內(nèi)參GAPDH引物:上游5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3，下游5-AGGGGCCATCCACAGT CTTC-3。

1.2 siRNA的設(shè)計(jì) 從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得Galectin-3基因序列(基因編號NM002306)，利用Ambion公司提供的軟件設(shè)計(jì)siRNA序列，經(jīng)Blast進(jìn)行同源序列比對，在Galectin-3 siRNA序列的不同部位選擇3條與其它基因序列比較同源性小于連續(xù)16nt的序列。siRNA sense5’-GUACAAUCAUCGGGUUAAATT-3’，antisense5’-UUUAACCCGAUGAUUGUACTG-3’;陰性對照組sense 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，antisense 5’-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3’;陽性對照組 GAPDH sense 5’-GUAUGACAACAGCCUCAAGT T-3’，antisense 5’-CUUGAGGCUGUUGUCAUACTT-3’;以上序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分為4組?？瞻讓φ战M(不加入siRNA和轉(zhuǎn)染劑)、轉(zhuǎn)染組(加入針對Galectin-3的siRNA及轉(zhuǎn)染劑)、陰性對照組(加入針對陰性對照的siRNA及轉(zhuǎn)染劑)、陽性對照組(加入針對內(nèi)參GAPDH的siRNA及轉(zhuǎn)染劑)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種在60 mm培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞為1.0×106/瓶。在37℃、5%CO2濃度、飽和濕度條件下培養(yǎng)，至60 mm培養(yǎng)瓶中細(xì)胞匯合率達(dá)到70%～80%。0.2%胎牛血清同步化24 h。按照上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司《RNAi產(chǎn)品使用手冊》每瓶加入siRNA 10 μg和Lipo 2000 10 μl進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.4 Real time-PCR及定量分析 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測RNA干擾對Galectin-3表達(dá)的抑制效果。Trizon法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR反應(yīng)體系參照試劑說明書。逆轉(zhuǎn)錄Galectin-3 mRNA為cDNA反應(yīng)條件:(1)37℃15 min;(2)85℃5 s。Galectin-3 cDNA擴(kuò)增條件:(1)預(yù)變性，95℃ 30 s，repeat 1;(2)PCR反應(yīng)，95℃5 s，58℃30 s，repeat 40。

1.5 Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白表達(dá)的檢測 37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白的表達(dá)情況。染色后的細(xì)胞爬片經(jīng)自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，每個(gè)爬片隨機(jī)取6個(gè)視野，每個(gè)視野分析細(xì)胞數(shù)約為30個(gè)，取其平均光密度值為量化指標(biāo)。

1.6 MTT法檢測癌細(xì)胞株的增殖情況 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)并吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 450 nm處測量各孔的吸光值，計(jì)算抑制率(抑制率=1－實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對照組OD值×100%)。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期數(shù)的變化 食管癌Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后用0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞，3 000 r/min離心5 min。用8 ml PBS制備單細(xì)胞懸液，加2 ml 75%預(yù)冷乙醇，吹打均勻，置4℃固定過夜。次日4℃ 3 000 r/min離心5 min，吸棄乙醇，用PBS重懸2次。加入PI染液500 μl，4℃避光孵育20 min，上機(jī)檢測，所得結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModF-it分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以ˉx±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果 Galectin-3及內(nèi)參GAPDH引物標(biāo)準(zhǔn)曲線，示M值分別為－2.732和－2.787，二者之差小于0.1，表示擴(kuò)增效率相同，可用△△Ct值法對二者進(jìn)行相對定量分析。Ct值和樣本起始拷貝數(shù)有對應(yīng)關(guān)系，Ct值越高起始拷貝數(shù)越少，對照組與實(shí)驗(yàn)組拷貝數(shù)之比為差異倍數(shù)即2-△△Ct，2-△△Ct＞1示表達(dá)下降，反之增高。實(shí)驗(yàn)組中Galectin-3 mRNA表達(dá)量低于兩對照組(P＜0.05)，而對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 不同組別中Eca-109食管癌細(xì)胞株△Ct值n=6，±s

表1 不同組別中Eca-109食管癌細(xì)胞株△Ct值n=6，±s

組別 △Ct P值轉(zhuǎn)染組4.39±1.16陰性對照組 1.79±0.62 0.000空白對照組1.89±0.15 0.000 0.843

2.2 Eca109食管癌細(xì)胞株的增殖情況 應(yīng)用Gal-3-siRNA轉(zhuǎn)染Eca-109食管癌細(xì)胞株后，通過倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，轉(zhuǎn)染組與陰性對照組、空白組比較，細(xì)胞生長變得緩慢，細(xì)胞體積變小，核質(zhì)比變小，瘤巨細(xì)胞減少，部分細(xì)胞脫落。運(yùn)用MTT法檢測Gal-3-siRNA干擾48 h后，轉(zhuǎn)染組Eca-109食管癌細(xì)胞的抑制率為59.71%，轉(zhuǎn)染組與空白對照組、陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表2 不同組別中Eca-109食管癌細(xì)胞株的OD值和抑制率n=10，±s

表2 不同組別中Eca-109食管癌細(xì)胞株的OD值和抑制率n=10，±s

組別 OD(±s) P值 抑制率(%)空白對照組1.43±0.12 -轉(zhuǎn)染組 0.58±0.19 0.000 59.71陽性對照組 0.77±0.18 0.000 0.350 46.15陰性對照組1.65±0.14 0.144 0.000 0.000 －15.38

2.3 Eca-109食管癌細(xì)胞Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白的表達(dá) 采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測siRNA干擾后Eca-109食管癌細(xì)胞Galectin-3蛋白陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核與細(xì)胞漿，CyclinD1、p21、p27蛋白陽性主要位于細(xì)胞核，均呈棕黃色或棕褐色。以IOD值作半定量分析，轉(zhuǎn)染組Galectin-3、CyclinD1、p21、p27蛋白表達(dá)均顯著低于空白對照組和陰性對照組(P＜0.01)。轉(zhuǎn)染組與陽性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 Galectin-3、CyclinD1、p21和p27蛋白在不同組別中的表達(dá) n=10，±s

表3 Galectin-3、CyclinD1、p21和p27蛋白在不同組別中的表達(dá) n=10，±s

組別IOD Galectin-3 CyclinD1 p21 p27轉(zhuǎn)染組2.96±0.22 39.5±0.8 29±4 26±5陽性對照組 2.85±0.21 40.4±0.6 28±3 25±4空白對照組 14.06±0.21 61.8±0.5 99±16 84±15陰性對照組13.25±0.10 62.3±0.6 93±14 78±13

2.4 流式細(xì)胞儀檢測各組癌細(xì)胞周期變化 Galectin-3-siRNA轉(zhuǎn)染食管癌細(xì)胞系Eca-109 48 h后，轉(zhuǎn)染組、陽性對照組G1期細(xì)胞數(shù)百分比較空白對照組和陰性對照組明顯升高，S期細(xì)胞數(shù)百分比較空白對照組和陰性對照組明顯減少(圖1～4)。轉(zhuǎn)染組、陽性對照組、陰性對照組和空白對照組G1期細(xì)胞數(shù)百分比分別為66.42±0.17、65.44±0.42、36.76±0.15和35.63± 0.36，轉(zhuǎn)染組、陽性對照組與空白對照組和陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染組、陽性對照組、陰性對照組和空白對照組S期細(xì)胞數(shù)百分比分別為23.2±1.3、24.3 ±1.7、46.8±0.8和45.3±0.7，轉(zhuǎn)染組、陽性對照組與空白對照組和陰性對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 不同組別中G1期和S期的百分比 n=3，±s

表4 不同組別中G1期和S期的百分比 n=3，±s

組別 G1期(%) S組(%)轉(zhuǎn)染組66.42±0.17 23.19±1.28陽性對照組 65.44±0.42 24.32±1.73空白對照組 35.63±0.36 45.33±0.72陰性對照組36.76±0.15 46.79±0.76

圖1 空白對照組細(xì)胞周期分布圖

圖2 陰性對照組細(xì)胞周期分布圖

圖3 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞周期分布圖

圖4 陽性對照組細(xì)胞周期分布圖

3 討論

人類Galectin-3基因位于染色體14q21-22，相對分子質(zhì)量約31×103，由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子組成。Galectin-3通過與其相應(yīng)配體相互作用參與多種生理和病理過程，包括細(xì)胞生長和凋亡、細(xì)胞粘附及新生血管形成和腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移等［2］。李曉明等［3］利用設(shè)計(jì)的Galectin-3-siRNA能夠使MCF-7乳腺癌細(xì)胞中Galectin-3的表達(dá)降低90%左右。當(dāng)用凋亡誘導(dǎo)劑處理時(shí)，Galectin-3被抑制的穩(wěn)定細(xì)胞株的凋亡率比野生型細(xì)胞株高出近20%。提出在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，Calectin-3具有抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的功能。在人類前列腺癌細(xì)胞株LNCaP中，Galectin-3可抵抗由順鉑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［4］。Takenka等［5］將Galectin-3 cDNA轉(zhuǎn)入到TAD-2甲狀腺濾泡細(xì)胞后，細(xì)胞出現(xiàn)集落性增殖，提示Galectin-3可能參與了細(xì)胞的有絲分裂。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換的RB(retinoblastoma)、PCNA(proliferating cell nucler antigen)、RCF(replication factor C)基因呈高表達(dá)。因此，提出Galectin-3在細(xì)胞增殖周期中發(fā)揮重要作用。雷彩霞等［6］采用siRNA技術(shù)抑制Galectin-3 mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果RL-95-2子宮內(nèi)膜上皮G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯下降，說明Galectin-3可以影響子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的生長周期。以上結(jié)果提示Galectin-3主要是通過細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡途徑參與腫瘤細(xì)胞的生長過程。本實(shí)驗(yàn)采用Lipo2000脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)染Eca-109食管癌細(xì)胞48 h后，轉(zhuǎn)染組Galectin-3 RNA及蛋白表達(dá)顯著低于空白對照組和陰性對照組，癌細(xì)胞生長開始變得緩慢，細(xì)胞體積縮小，核質(zhì)比變小，瘤巨細(xì)胞減少。轉(zhuǎn)染組癌細(xì)胞增殖活性顯著降低，細(xì)胞主要停留在G1期，與空白對照組和陰性對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致，提示Galectin-3在Eca-109食管癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。

Cyclin-D1蛋白是細(xì)胞周期素中的重要一員，它可促進(jìn)細(xì)胞快速通過G1期，加速G1/S期的轉(zhuǎn)化，從而可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，使得腫瘤快速生長、發(fā)展。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中Cyclin-D1蛋白發(fā)生了染色體的易位，而導(dǎo)致Cyclin-D1蛋白的表達(dá)增加，從而引起細(xì)胞周期調(diào)控異常，出現(xiàn)細(xì)胞增殖紊亂［7］。Yan等［8］利用反義RNA載體轉(zhuǎn)染2BS細(xì)胞系，使得Cyclin D1蛋白的表達(dá)下降，促使細(xì)胞停留在G1期，同時(shí)降低二氧化硅對2BS細(xì)胞的致癌能力。最新研究發(fā)現(xiàn)Galectin-3是Wnt/β-catenin信號途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其與β-catenin、TCF-4組成三元復(fù)合物，共同活化CyclinD1的轉(zhuǎn)錄［9］。p27和p21作為細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，具有廣泛抑制各種細(xì)胞周期蛋白和激酶的活性，作為CyclinECDK2、CyclinD-CDK2等G1期激酶復(fù)合體的抑制劑，二者以化學(xué)計(jì)量的方式抑制現(xiàn)已知的大多數(shù)Cyclin-CDK的磷酸化激酶活性而阻止細(xì)胞通過G1/S期轉(zhuǎn)化的限制點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞周期調(diào)控。Wang等［10］在敲出人類前列腺PC3細(xì)胞株Galectin-3后使細(xì)胞停滯于G1期，并上調(diào)核P21表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過Gal-3-siRNA抑制Galectin-3蛋白表達(dá)后，細(xì)胞增殖活性受到抑制，同時(shí)CyclinD1蛋白表達(dá)下降、p27和p21蛋白表達(dá)升高，提示Galectin-3參與Eca-109食管癌細(xì)胞增殖的作用與CyclinD1、p27和p21蛋白關(guān)系密切，Galectin-3有望成為食管癌抑制的靶基因。

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Effects of Galectin-3 small interfering RNA on the expressions of Cyclin D1，p21，p27 protein and the effect on cell proliferation of Eca109 esophageal carcinoma cell line

ZOU Guohong*，SUN Junxiang，SU Zheng，et al.*Department of Thoracic Surgery，Tangshan People’s Hospital，Hebei，Tangshan06300，China

ObjectiveTo observe the changes of cell proliferation activity and expressions of Galectin-3，CyclinD1，p21 and p27 protein in Eca-109 cell line after transfected by Galectin-3 small interfering RNA (siRNA).MethodsThe Galectin-3 siRNA chain was constructed and transfected into Eca-109 cell line by lipofectamine 2000，then Real-time PCR，MTT，F(xiàn)low cytometry and immuocytochemistry were respectively used to detect the transfection efficiency of siRNA，the cell proliferation activity，cell cycle distribution and the expression levels of Galectin-3，Cyclin D1，p21 and p27protein in Eca-109 cell line.ResultsThe cell proliferation activity of Eca-109 cell line was significantly decreased，and cell distribution was mainly at G1 stage，and the expression levels of Galectin-3 and Cyclin D1 were decreased，however，the expression levels of p21 and p27 protein were increased.ConclusionThe application of siRNA can effectively inhibit the expression of Galectin-3 and cell proliferation activity of Eca-109 cell line，and Galectin-3 is involved in the proliferation of Eca-109 cell line and is closely correlated with the expressions of Cyclin D1，p21，p27 protein，which may become the target gene for treating esophageal cancer.

galectin-3;cyclinD1;p21;p27;Real-time PCR，siRNA;esophageal cancer

R 735.1

A

1002－7386(2012)17－2565－03

10.3969/j.issn.1002－7386.2012.17.001

063000 河北省唐山市人民醫(yī)院胸外科(鄒國紅);河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室(孫軍祥、蘇正、董麗儒、宋旭東)

宋旭東，063000 河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室; E-mail:songxd2002@sina.com

2011－12－30)