楊尚武 黃 浩 王小婕 朱秀蘭 宋亞麗 修良昌 邢福祺

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心(廣州，510515);2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院;3.廣東醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院統(tǒng)計學(xué)教研室

·基礎(chǔ)研究·

小鼠卵子老化過程中皮質(zhì)顆粒的變化和自發(fā)孤雌激活的研究

楊尚武1，2黃 浩2王小婕2朱秀蘭1宋亞麗1修良昌3邢福祺1

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心(廣州，510515);2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院;3.廣東醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院統(tǒng)計學(xué)教研室

目的:通過卵子老化過程中皮質(zhì)顆粒的變化和自發(fā)孤雌激活比例，探討老化卵子受精異常的原因。方法:對8～10周齡雌鼠注射孕馬血清促性腺激素和絨毛膜促性腺激素14h后，于不同時間段取出MII期成熟卵子分作體內(nèi)不同時間老化組(MII+0h、MII+6h、MII+12h、MII+18h);成熟M II+0h卵子取出后體外分別培養(yǎng)6h、12h、18h作為體外老化組。對各組卵子免疫熒光染色，共聚焦顯微鏡成像顯示染色體形態(tài)和皮質(zhì)顆粒分布。體內(nèi)各組卵子取出后繼續(xù)體外培養(yǎng)8h統(tǒng)計自發(fā)孤雌激活的比例和碎裂卵子數(shù)。結(jié)果:體內(nèi)和體外MII+12h、MII+18h組自發(fā)皮質(zhì)顆粒排放比例和皮質(zhì)顆粒內(nèi)遷數(shù)明顯高于MII+0h、MII+6h組。體外MII+18h組自發(fā)皮質(zhì)顆粒排放比例和皮質(zhì)顆粒內(nèi)遷數(shù)低于體內(nèi)MII+18h組。體內(nèi)MII+12h、MII+18h組卵子取出繼續(xù)體外培養(yǎng)8h后孤雌激活比例和死亡比例明顯高于體內(nèi)MII+0h和MII+6h組。結(jié)論:卵子在老化過程中存在皮質(zhì)顆粒自發(fā)排放和皮質(zhì)顆粒內(nèi)遷，以及自發(fā)孤雌激活和碎裂化，這些因素均可能導(dǎo)致老化卵受精能力的降低。卵子老化過程中皮質(zhì)顆粒排放和內(nèi)遷可能受到體內(nèi)環(huán)境的影響。

小鼠 卵子 老化 皮質(zhì)顆粒 孤雌激活

排卵后老化是指當(dāng)卵母細(xì)胞到達(dá)第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)后，因未能受精，減數(shù)分裂不能繼續(xù)完成，而持續(xù)停滯在這一階段所發(fā)生的老化。卵母細(xì)胞的老化會導(dǎo)致妊娠率降低、流產(chǎn)率增加和出生缺陷。研究排卵后卵母細(xì)胞老化過程及機(jī)制，探討延緩卵母細(xì)胞老化的有效措施，對于改進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟和受精系統(tǒng)，完善輔助生殖技術(shù)并減少出生缺陷具有重要的理論價值。既往研究顯示，皮質(zhì)顆粒(CG)是卵子成熟和檢驗卵子質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究通過觀察超排的小鼠成熟卵不同老化時間和老化環(huán)境下的CG變化以及老化卵體外培養(yǎng)自發(fā)孤雌激活的改變，探討卵母細(xì)胞老化的變化規(guī)律及對受精和發(fā)育產(chǎn)生影響的可能因素。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑、儀器

雌鼠購自北京大學(xué)北校區(qū)實驗動物中心。孕馬血清促性腺激素(PMSG)和絨毛膜促性腺激素(hCG)購自寧波制藥廠。其他主要試劑和儀器有:碘化丙啶(PI)，異硫氰酸熒光素絡(luò)合小扁豆凝集素(FITCLCA)(Sigma公司，美國);M2操作液、M16培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibco公司，美國);leica解剖顯微鏡(萊卡公司，德國);ZEISS－510 META激光共聚焦顯微鏡(蔡司公司，德國)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物處理和分組8～10周ICR品系雌鼠于發(fā)情后期腹腔注射PMSG 10U，48h后腹腔注射hCG 10U，推定hCG注射14h后為卵子體內(nèi)成熟MII期。分別于MII期后不同時間采取斷頸法處死小鼠，取出卵子，作為體內(nèi)不同時間老化組(MII+0h、MII+6h、MII+12h、MII+18h);另一批小鼠 MII期斷頸處死取出卵子后，置入M16培養(yǎng)液于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h、12h、18h，作為體外老化卵組。卵子獲得:取出子宮輸卵管，挑破輸卵管膨大部位，得到卵丘復(fù)合物(COC)。用0.1%透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞后得到MII卵，M2操作液洗3遍，轉(zhuǎn)入Tyrode酸性液消化透明帶，進(jìn)行CG熒光染色。

1.2.2卵子CG熒光染色卵子去掉透明帶后，4%多聚甲醛固定30min，于含0.3%胎牛血清蛋白(BSA)和100mmol/L甘氨酸的PBS液(阻斷液)中洗3次，含0.1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX－100)的PBS(透膜液)中透膜5 min，再次置入阻斷液中洗3次。100μg/ml FITC－LCA(以PBS稀釋)避光孵育45min。含0.3%BSA和0.01%TritonX－100的PBS(洗脫液)洗3次，10μg/ml PI暗室環(huán)境下染核10min。DABCO封片，置于激光共聚焦顯微鏡上，用激發(fā)波長488nm光觀察。成熟CG分布標(biāo)準(zhǔn):卵子赤道面CG排布在質(zhì)膜下，形成單層細(xì)致的光環(huán)，從皮質(zhì)面觀察可見CG的分布細(xì)致均勻。CG排放的標(biāo)準(zhǔn):卵子赤道面質(zhì)膜下CG光環(huán)斷裂、不連續(xù)、伴凝集，從皮質(zhì)面觀察可見CG凝集成團(tuán)塊狀、分布不均勻。CG內(nèi)遷的標(biāo)準(zhǔn):卵子赤道面CG數(shù)目≥6個。

1.2.3卵子老化自發(fā)孤雌激活的觀察按上述方法取得各不同時間組老化卵子后，置入M16培養(yǎng)液于37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中8h，倒置顯微鏡下統(tǒng)計分化到2細(xì)胞卵子數(shù)和碎裂卵子數(shù)。

1.3 統(tǒng)計分析

每組至少3次獨立重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)用平均數(shù)表示;以SPSS17.0軟件進(jìn)行l(wèi)ogisitic回歸分析和χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 卵子CG熒光染色

圖1A顯示新鮮成熟卵子CG的分布:從皮質(zhì)面觀察可見CG的分布細(xì)致均勻;從赤道面觀察可見CG形成單層細(xì)致連續(xù)的光環(huán)，且胞漿內(nèi)無CG。圖1B顯示老化卵子已排放CG:從皮質(zhì)面觀察可見CG凝集成團(tuán)塊狀、分布不均勻;在赤道面質(zhì)膜下CG光環(huán)斷裂、不連續(xù)、伴凝集，且CG內(nèi)遷至胞漿內(nèi)。

圖1 成熟卵子(A)及老化卵子(B)CG分布

2.2 卵子老化不同時間CG排放和內(nèi)遷

體內(nèi)成熟卵子在體內(nèi)和體外老化MII+12h、MII+18h組與MII+0h組相比，CG排放和內(nèi)遷均有明顯變化。見表1。以是否發(fā)生CG排放反應(yīng)作為應(yīng)變量，以實驗類型(體內(nèi)、體外)和時間點作為自變量進(jìn)行l(wèi)ogisitic回歸分析，結(jié)果實驗類型和時間均有統(tǒng)計學(xué)意義。體內(nèi)與體外相同老化時間組比較，只有MII+18h組CG排放有明顯變化(P＜0.05)。以是否發(fā)生CG內(nèi)遷作為應(yīng)變量，以實驗類型(體內(nèi)、體外)和時間點作為自變量進(jìn)行l(wèi)ogisitic回歸分析，結(jié)果時間有統(tǒng)計學(xué)意義，實驗類型無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 卵子老化自發(fā)孤雌激活

體內(nèi)MII+12h和MII+18h組卵子繼續(xù)體外培養(yǎng)8h，孤雌激活2細(xì)胞數(shù)和碎裂卵子數(shù)明顯高于體內(nèi)MII+0h和MII+6h組。見表2。

表1 卵子老化不同時間各組CG排放和內(nèi)遷情況比較［例(%)］

表2 體內(nèi)各組繼續(xù)體外培養(yǎng)8h后卵子情況比例［例(%)］

3 討論

小鼠卵母細(xì)胞成熟排卵后停滯于MII期，此間如果有精子穿入則會恢復(fù)減數(shù)分裂形成受精卵開始發(fā)育進(jìn)程。如果沒有精子穿入則會發(fā)生細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核的一系列變化，最終導(dǎo)致卵母細(xì)胞的老化。老化卵母細(xì)胞受精能力和發(fā)育能力均明顯下降，甚至出現(xiàn)不受精的情況，其受精產(chǎn)生的后代繁殖性能和壽命亦較正常卵差［1，2］。卵母細(xì)胞的老化機(jī)制是什么，在老化過程中究竟發(fā)生了哪些變化，如何客觀評價卵子老化的程度和狀態(tài)，進(jìn)而分析受精失敗的原因，一直是臨床工作面臨的難題。本研究通過觀察卵子老化過程CG變化、孤雌激活和卵子死亡碎片變化來探討老化卵對受精的影響。

3.1 CG在卵子發(fā)育成熟和老化過程中的變化

CG是大多數(shù)哺乳動物卵母細(xì)胞所特有的直徑為0.2～0.6μm 的圓形顆粒結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞質(zhì)中的分布隨卵母細(xì)胞的生長發(fā)育呈明顯的變化。其合成初期隨機(jī)分布于細(xì)胞質(zhì)中，之后逐漸向皮質(zhì)區(qū)遷移，于排卵前呈單層分布于質(zhì)膜下，并形成約占皮質(zhì)40%的無CG區(qū)。這一過程由微絲介導(dǎo)［3，4］。卵母細(xì)胞成熟過程中的CG遷移及在皮質(zhì)區(qū)的重新分布，是判斷卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的一項重要指標(biāo)。CG是防止多精子受精、保證正常受精的一種重要細(xì)胞器。研究卵子老化過程中CG這一細(xì)胞器的改變，亦可能是判斷卵子胞質(zhì)質(zhì)量和卵子質(zhì)量的重要指標(biāo)。本研究中發(fā)現(xiàn)體內(nèi)成熟卵子在體內(nèi)和體外老化12h后均存在較高比例CG自發(fā)排放和內(nèi)遷過程。Díaz等［5］研究發(fā)現(xiàn)新鮮成熟卵體外受精發(fā)育至2細(xì)胞比例達(dá)66.3%，當(dāng)用老化20h卵行體外受精時這一比例降至16.85%。新鮮卵子透明帶厚6～7μm，為均一結(jié)構(gòu)，而老化20h卵子部分透明帶內(nèi)層變得致密，而外層相對透明。PTA染色顯示82.14%老化卵透明帶內(nèi)層明顯深染，外層相對淡染，均呈帶狀結(jié)構(gòu)，電子顯微鏡提示老化卵卵周隙明顯加大。老化卵子透明帶消化時間明顯增加，提示透明帶硬化，老化卵子受精率下降可能與這一反應(yīng)有關(guān)［5，6］。本研究觀察到老化卵中存在自發(fā)CG排放的現(xiàn)象。自發(fā)排放的CG可能激活了透明帶反應(yīng)，阻止老化卵子受精，從而避免老化卵對受精質(zhì)量的不良影響，這可能是生物自發(fā)保護(hù)機(jī)制之一。有研究［7］發(fā)現(xiàn)促分裂原活化蛋白激酶在老化卵中活性明顯下降，可能是CG自發(fā)排放的原因。

3.2 老化卵孤雌激活和卵子死亡碎片化

卵子孤雌激活是指阻滯在第2次減數(shù)分裂中期的卵母細(xì)胞在某些理化因子的作用下活化而啟動由卵母細(xì)胞自身控制的孤雌發(fā)育。在卵子受精或孤雌激活過程中有類似的激活機(jī)制:細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加，細(xì)胞靜止因子(CSF)和成熟促進(jìn)因子(MPF)水平下降，卵母細(xì)胞離開MII期，完成減數(shù)分裂，進(jìn)入胚胎發(fā)育［7，8］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn):體內(nèi)老化卵子 MII+12h和MII+18h組卵子取出后繼續(xù)體外培養(yǎng)8h后孤雌激活2細(xì)胞和碎裂卵子數(shù)明顯高于MII+0h組，表明不同老化時期卵子隨著老化時間延長孤雌激活比例明顯增加。卵細(xì)胞孤雌激活一方面可能會誘導(dǎo)CG自發(fā)排放，降低受精能力，另一方面提示卵子老化到一定時段胞質(zhì)和遺傳物質(zhì)已經(jīng)在無精子誘發(fā)前提下自發(fā)啟動有絲分裂周期，從而阻止精卵融合發(fā)育成合子的可能。在小鼠老化MII+12h和MII+18h組中卵子碎片率增加，提示部分老化卵子已經(jīng)在受精前啟動了凋亡過程。

3.3 卵子老化與周圍環(huán)境關(guān)系

排卵后的卵子周圍包裹著顆粒細(xì)胞，顆粒細(xì)胞加速卵子老化過程。含有顆粒細(xì)胞的體內(nèi)老化卵其MPF活性較無顆粒細(xì)胞體外老化卵下降明顯，當(dāng)體外老化卵與顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)后，MPF活性下降明顯加快，激活概率明顯增加［9］。丙酮酸可以減緩顆粒細(xì)胞引起的老化進(jìn)程［10］。本研究顯示:在體內(nèi)與體外相同老化時間組比較，體內(nèi)老化18h組CG自發(fā)排放比例高于體外組，提示與體外培養(yǎng)環(huán)境相比，體內(nèi)輸卵管環(huán)境更容易導(dǎo)致卵子老化，老化卵子CG排放可能受到體內(nèi)顆粒細(xì)胞的影響，顆粒細(xì)胞可以加速卵子自發(fā)CG排放過程。

總之，本研究結(jié)果顯示，小鼠卵子成熟后12h即可見老化現(xiàn)象，即CG自發(fā)排放，自發(fā)排放的CG可能進(jìn)而激活了透明帶反應(yīng)，阻止老化卵子受精，從而避免老化卵對受精質(zhì)量的不良影響。這可能是生物自發(fā)保護(hù)機(jī)制之一。老化卵隨時間延長孤雌激活比例、卵子碎片死亡率也明顯增加。卵細(xì)胞孤雌激活一方面可能會誘導(dǎo)CG自發(fā)排放，降低受精能力，另一方面可阻止精卵結(jié)合。卵子發(fā)生碎片化死亡亦是老化卵受精異常的原因之一。

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2 Tarín JJ，Pérez－ Albalá S，Pérez－ Hoyos S，et al.Postovulatory Aging of Oocytes Decreases Reproductive Fitness and Longevity of Offspring［J］.Biol Reprod，2002，66(2):495 －499.

3 Wang WH，Sun QY，Hosoe M，et al.Quantified analysis of cortical granule distribution and exocytosis of porcine oocytes during meiotic maturation and activation［J］.Biol Reprod，1997，56(6):1376 －1382.

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Cortical granule change and spontaneous parthenogenetic activation during mouse oocytes aging

Yang Shangwu1，2，Huang Hao2，Wang Xiaojie2，Zhu Xiulan1，Xiu Liangchang3，Xing Fuqi1
1.Center of Reproductive Medicine，Southern Hospital Affiliated to Southern Medical university，Guangzhou510515;2.Nanhai Hospital Affiliated to Southern Medical university;3.School of Public Health，Guangdong Medical University.

Objective:To explore the cortical granule(CG)change and parthenogenetic activation during mouse oocyte aging.Methods:Female mice，8－10 weeks of age，were induced to superovulation with pregnant mare serum gonadotropin(PMSG;10U，i.p.)followed 48 h later by hCG(10 U，i.p.).Oocytes were retrieved at different time intervals(MII+0h，+6h，+12h，+18h)(in vivo aging)or MII+0h oocytes cultured for different time periods(+6h，+12h，+18h)(in vitro aging).CG distribution and release were assessed by fluorescene isothiocyanate－labelled Lens culinaris agglutinin(FITCLCA)staining and laser confocal microscopy.Spontaneous parthenogenetic activation and fragmentation of oocytes were observed after anther 8h of culture of different in vivo aging groups.Results:Spontaneous cortical granule exocytosis(CEG)and CG inward movement rates in MII+12h，MII+18h groups were statistically higher than those in MII+0h，MII+6h groups in both in vivo and in vitro aging oocytes.Spontaneous CGE and CG inward movement in M+18h group was lower in in－vitro aging group than those of in vivo aging counterpart.Spontaneous parthenogenetic activation and oocyte fragmentation ratios after further 8h of culture were higher in MII+12h，MII+18h groups than those in MII+0h，MII+6h groups.Conclusion:Spontaneous CGE and CG inward movement increased during oocyte aging both in vivo and in vitro.There were also increased parthenogenetic activation and oocyte fragmentation ratios as oocyte aged.All these may cause the low fertility of aged oocyte.Spontaneous CGE and CG inward movement may be accelerated by maternal environment changes.

Mouse;Oocyte;Cortical granule;Aging;Parthenogenetic activation

10.3969/j.issn.1004 －8189.2012.11

國家自然科學(xué)基金項目(編號:30930065)

2012－04－23

2012－07－08

［責(zé)任編輯:王麗娜］