李 貴，陶 鵬，李必元，王五宏，岳智臣，鐘新民

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室，江蘇 南京 210095)

結(jié)球甘藍 (Brassica oleracea L.var.capitata L.)屬十字花科蕓薹屬，是甘藍 (Brassica oleracea L.)的一個亞種，起源于地中海沿岸［1］，是我國的主要蔬菜作物之一。近年來為了提高植物的抗病性和抗逆性，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因工程技術(shù)將目的基因?qū)?，可在保持原有?yōu)良背景的基礎(chǔ)上改良目標性狀，為品種改良開辟了新的途徑。植物外植體的離體培養(yǎng)，建立高頻率的再生體系是基因轉(zhuǎn)化技術(shù)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通常情況下，離體再生頻率越高，轉(zhuǎn)化頻率也越高［2］。前人研究結(jié)果表明，植株外植體的高效再生與很多因素有關(guān)，不僅與植物生長調(diào)節(jié)劑的類型、濃度有關(guān)，還與外植體類型、基因型、生理狀態(tài)及乙烯抑制劑的應(yīng)用有關(guān)［3-5］。本試驗在前人研究的基礎(chǔ)上，以結(jié)球甘藍強力50(QL50)和甘19CMS的下胚軸為外植體，研究不同激素配比、Ag+、外植體的生理狀態(tài) (苗齡)等對下胚軸外植體再生的影響，以建立高效的結(jié)球甘藍下胚軸再生體系，為下一步的基因轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為結(jié)球甘藍強力50和甘19CMS，均由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供，取其無菌實生苗下胚軸為外植體。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗培養(yǎng)

將結(jié)球甘藍的種子用清水沖洗干凈，置于75%的酒精中浸泡0.5 min，用0.1%的HgCl2表面消毒3 min，最后用無菌水沖洗4次，接種于無激素的 MS(蔗糖30 mg·L-1+瓊脂7 mg·L-1，pH為5.8)培養(yǎng)基上。于 (25±2)℃、光照強度1 800 lx，16 h光/8 h暗的光周期培養(yǎng)無菌苗。

1.2.2 不同激素組合試驗

不同激素組合，設(shè)6-BA濃度0，1，2，3，4 mg·L-1，與 NAA 濃度 0，0.02，0.2，0.5，0.8 mg·L-1進行完全隨機組合。在材料適宜苗齡時，切取0.5 cm長的下胚軸放入加有不同激素組合的MS(蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1)分化培養(yǎng)基中。用培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)，每皿接種40個外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)20 d后，調(diào)查不定芽的生長情況。

1.2.3 AgNO3與激素組合試驗

從上步試驗出芽較好的激素組合再與不同濃度的 AgNO3(0，2，4，6，8，10 mg·L-1)設(shè)計組合進行外植體培養(yǎng)。AgNO3采用過濾滅菌。培養(yǎng)20～25 d統(tǒng)計不定芽分化率。1.2.4 苗齡試驗

在篩選出來的出芽較好的培養(yǎng)基上接種取自不同苗齡 (3，6，9，12，15，18，21 d)的外植體。培養(yǎng)20～25 d統(tǒng)計不定芽分化率。

1.2.5 不定芽生根與植株移栽

當分化培養(yǎng)基中的不定芽長到2～3 cm時，切取后轉(zhuǎn)入含不同生長素的1/2 MS培養(yǎng)基 (IBA 0.2，0.5 mg·L-1，NAA0.2，0.5 mg·L-1)中，待芽基部形成大量的毛根后，打開三角瓶口，煉苗4～5 d后取出小植株，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到基質(zhì)中，篩選適宜結(jié)球甘藍生根的培養(yǎng)基。

1.3 不定芽再生頻率與再生系數(shù)的計算

不定芽再生頻率/%=(再生不定芽的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)) ×100;不定芽再生系數(shù)(單個外植體再生芽數(shù))=外植體再生的不定芽總數(shù)/再生不定芽的外植體總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素濃度對不定芽再生的影響

外植體接種于不同激素濃度的誘導(dǎo)培養(yǎng)基4～5 d后明顯增大，大多數(shù)不定芽于接種后15～25 d之間產(chǎn)生，接種后1個月左右仍有極少數(shù)不定芽發(fā)生。細胞分裂素與生長素濃度的不同配比影響下胚軸誘導(dǎo)不定芽的頻率，不同激素組合的再生頻率結(jié)果 (表1)表明:6-BA和NAA對結(jié)球甘藍不定芽的誘導(dǎo)都是必要的，在MS培養(yǎng)基上單獨添加各種濃度的NAA或6-BA，其下胚軸外植體均不能再生不定芽，在不含任何激素的MS培養(yǎng)基上，也不能再生不定芽，大部分外植體在接種后15 d左右褐化死亡;在6-BA與NAA組合中，隨著6-BA濃度的升高，2個品種的不定芽再生率和再生系數(shù)略有上升;在6-BA的濃度一定時，不定芽再生率隨著NAA濃度的升高而降低，當NAA濃度高于0.5 mg·L-1時，不定芽再生率開始明顯下降;在NAA濃度為0.02 mg·L-1的處理中，QL50下胚軸的再生頻率隨著6-BA濃度的增加相應(yīng)增加，當6-BA的濃度為2 mg·L-1時，其下胚軸不定芽再生頻率達到最高 (圖 1中 A)，為 89.13，再生系數(shù)為7.17，單個外植體上再生的不定芽數(shù)最高可達24個 (圖1中B);在 NAA濃度為0.2 mg·L-1，6-BA的濃度為2 mg·L-1的處理中，甘19CMS不定芽再生頻率達到最高，為64.67，再生系數(shù)為5.8;在NAA濃度為0.8 mg·L-1的處理中，2種材料的下胚軸不定芽再生頻率明顯下降，且在切口處有大量的不定根長出，大部分外植體在接種后20 d左右黃化褐死，再生率極低。

表1 NAA與6-BA配合對結(jié)球甘藍離體下胚軸不定芽再生的影響

2.2 AgNO3濃度對不定芽再生的影響

由表2可知，QL50在 9 d苗齡時，下胚軸在分化培養(yǎng)基MS+0.02 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA;甘19CMS在苗齡6 d時，下胚軸在分化培養(yǎng)基 MS+0.2 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA中分別添加2，4，6，8，10 mg·L-1的 AgNO3后，外植體的不定芽再生率隨AgNO3濃度的升高而升高后下降。當AgNO3濃度為6 mg·L-1時，外植體的不定芽再生率由原來不添加 AgNO3時的89.1%和64.7%分別增高到93.0%和70.9%，平均再生系數(shù)分別達到9.17和6.97，隨AgNO3濃度的繼續(xù)升高，不定芽再生頻率和再生系數(shù)均下降，并發(fā)現(xiàn)AgNO3濃度過高，外植體切口處褐化，再生的畸形芽也多，隨濃度變高，褐化現(xiàn)象越嚴重。說明適當濃度的AgNO3對子葉不定芽再生有顯著的促進作用。

表2 AgNO3對結(jié)球甘藍離體下胚軸不定芽再生的影響

2.3 苗齡對不定芽再生的影響

由表3可以看出，不同苗齡QL50下胚軸在分化培養(yǎng)基 MS+0.02 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA，甘19CMS下胚軸在分化培養(yǎng)基MS+0.2 mg·L-1NAA+2 mg·L-16-BA中，下胚軸的不定芽再生率隨著苗齡增加均不斷增加，QL50下胚軸在9 d苗齡時再生率最高，達到89.1%，甘19CMS在6 d苗齡時再生率最高，達到69.2%;隨著苗齡的增加再生率均不斷降低，當?shù)搅?5 d苗齡時再生率極低，當苗齡21 d時再生頻率基本為零，外植體全部褐化死亡。

表3 不同苗齡對結(jié)球甘藍離體下胚軸不定芽再生的影響

2.4 不定芽的生根

由表4可知，再生的不定芽在含有0.5 mg·L-1NAA的培養(yǎng)基上生根效果最好，再生的主根較多 (圖1中C)，而在含有0.5 mg·L-1IBA的培養(yǎng)基上再生的須根較多，再生的主根的數(shù)量很少(圖1中D)。不定芽在生根培養(yǎng)基中20 d后可形成較多的不定根，此時獲得完整的再生植株 (圖1中E)。再生植株經(jīng)馴化煉苗后移入營養(yǎng)缽中，套塑料袋保濕。1周后去袋，再培養(yǎng)15 d左右，移栽到大花缽中讓其充分生長，直至現(xiàn)蕾、開花。

圖1 QL50下胚軸再生系統(tǒng)的建立

表4 不同生長素對不定芽誘導(dǎo)生根的影響

3 小結(jié)與討論

在植物離體培養(yǎng)中，外源細胞分裂素、生長素對不定芽的誘導(dǎo)和生長發(fā)育具有重要作用。一般認為，細胞分裂素與生長素質(zhì)量濃度的適宜配比是植物不定芽分化的重要條件，細胞分裂素有利于芽的誘導(dǎo)分化，生長素有利于根的誘導(dǎo)分化，二者同時使用，質(zhì)量濃度比值高時產(chǎn)生芽，質(zhì)量濃度比值適中時可維持原組織生長而不發(fā)生分化［6-7］。十字花科蕓薹屬作物在無性繁殖時，添加一定質(zhì)量濃度的外源激素能夠促進外植體不定芽的分化［8］。在本試驗中，誘導(dǎo)結(jié)球甘藍下胚軸再生不定芽時，選用6-BA和NAA 2種激素，在適宜濃度配比時能誘導(dǎo)出大量的不定芽，在只含有6-BA或NAA的培養(yǎng)基中，外植體均不能誘導(dǎo)出不定芽，這說明在不定芽的誘導(dǎo)過程中，細胞分裂素和生長素都是必須的，并且要求適宜的激素配比才能高效的誘導(dǎo)外植體不定芽的產(chǎn)生。這與許念芳等［9-18］的試驗結(jié)果一致。

植物細胞在離體培養(yǎng)過程中會產(chǎn)生乙烯，其過度積累會影響外植體的生長和不定芽的分化。據(jù)報導(dǎo)，在用外植體誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基中加入AgNO3可顯著的提高蕓薹屬植物的植株再生頻率［19-22］。本研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加AgNO3后，再生率可提高;但隨著AgNO3濃度的繼續(xù)升高，不定芽再生頻率和再生系數(shù)均下降，并且試驗中發(fā)現(xiàn)AgNO3濃度過高，外植體部分褐化，再生的畸形芽也多，濃度越高，褐化現(xiàn)象越嚴重。說明適當濃度的AgNO3對不定芽再生有促進作用，而較高濃度的AgNO3對不定芽再生具有一定的副作用，這與前人的研究結(jié)果相一致［23］。

外植體的生理狀態(tài)對不定芽再生的影響較大，選用適宜苗齡的無菌苗外植體能夠獲得較高的再生頻率。有研究表明，不同取材時期的甘藍下胚軸，其不定芽的分化有較大的差別［24］。本研究的試驗結(jié)果與此一致，當苗齡在6～9 d時，不定芽的分化頻率最高;當苗齡在15 d時，不定芽的分化頻率非常低;當苗齡21 d時不定芽的分化頻率基本為零。

根系健壯是試管苗成為再生植株的重要保證。有研究表明［25］，在不定根形成過程中，生長素起著主要作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)再生芽在含IBA和NAA 2種激素的培養(yǎng)基上均能生根，但是NAA處理中不定芽再生的根系主根明顯要比IBA處理中的多，再生苗更容易成活。

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