俞永裕，曾 濤，陳曉青，姜柏芳，毛濟(jì)敖，田 勇，沈軍達(dá)，陶爭榮，盧立志

(1.浙江省余姚市畜牧獸醫(yī)局，浙江 余姚 315499;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021;3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095;4.余姚市舜豐畜禽養(yǎng)殖有限公司，浙江 余姚 315499)

余姚番鴨 (又名瘤頭鴨、呆頭鴨)是一種瘦肉型肉用鴨。余姚番鴨按羽色分為白羽、花羽和灰色條紋羽3個類群，灰色條紋羽現(xiàn)較少。余姚番鴨具有生長速度快，屠宰率高等特點，許多地方引種飼養(yǎng)。

微衛(wèi)星又稱為簡單重復(fù)序列 (SSR)，一般以1～6個堿基為核心序列，首尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列。微衛(wèi)星標(biāo)記與其他分子標(biāo)記相比，具有在基因組中數(shù)量分布廣而均勻、多態(tài)性豐富、等顯性遺傳以及分析方法簡便、快捷等優(yōu)點。因此，微衛(wèi)星標(biāo)記目前已被廣泛應(yīng)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣檢測的研究中［1-10］。在過去的幾年里，已經(jīng)從鴨類基因組中分離到了很多多態(tài)性豐富的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記［11-12］，為鴨類的微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記和生產(chǎn)性狀關(guān)系的研究打下了良好的基礎(chǔ)。本研究分析了16個微衛(wèi)星標(biāo)記與余姚番鴨體尺性狀間的相關(guān)性，為余姚番鴨的選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用30只余姚番鴨，公母各半。編號采集血樣樣本，測量體重和體尺，測量指標(biāo)包括體重、體斜長、龍骨長、脛長、脛圍、胸寬、胸深和骨盆寬。

1.2 血液基因組DNA的提取

采用常規(guī)酚-氯仿抽提法，具體操作步驟參照《分子克隆》(第3版)，稍加修改。

1.3 微衛(wèi)星位點及PCR條件

根據(jù)GenBank和文獻(xiàn)上提供的50對微衛(wèi)星引物進(jìn)行篩選，選擇了16對微衛(wèi)星引物 (表1)。

反應(yīng)體系 (25.0 μL):50 ng·μL-1DNA 1 μL，上下游引物各為 0.4 μL，10 mmol·L-1dNTP混合物 1.5 μL，10 × 緩沖液 1.5 μL，rTaq 酶0.25 μL。

反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，44～65℃ (具體溫度依引物而定，表1)復(fù)性30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用12%的非變性聚丙烯酰胺進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后用硝酸銀染色，成像后分析結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及相關(guān)公式

統(tǒng)計各等位基因組成，計算個微衛(wèi)星座位的等位基因頻率 (Pi)、遺傳雜合度 (He)、多態(tài)信息含量 (PIC)和有效等位基因數(shù) (Ne)。用SPSS軟件分析微衛(wèi)星基因座各基因型與體尺性狀間的相關(guān)性。

表1 16個微衛(wèi)星引物序列和退火溫度

式中:pi為第 i個等位基因的頻率;i為純合復(fù)等位基因;ij1，ij2，…，ijn為與 i共顯的第1到第n個等位基因。

2 結(jié)果和分析

2.1 遺傳多態(tài)性的指標(biāo)

用16對微衛(wèi)星引物對余姚番鴨進(jìn)行檢測，結(jié)果共檢測到72個等位基因，各座位等位基因數(shù)位2～7個，由表2可知，16個微衛(wèi)星標(biāo)記所檢測到群體平均雜合度為0.681。多態(tài)信息含量最高的微衛(wèi)星座位是 AY493314(0.832)，最低的是AY587043(0.374)，平均多態(tài)信息含量為0.644。

2.2 遺傳多態(tài)性與體尺性狀的相關(guān)性

用SPSS(16.0)中GLM過程對各個不同微衛(wèi)星位點的不同基因型間性狀的差異進(jìn)行最小二乘分析，結(jié)果見表3。微衛(wèi)星AY493314與脛圍呈極顯著相關(guān)，AJ272582與脛圍和龍骨長呈顯著相關(guān);微衛(wèi)星AY493282，APL515883與脛長呈顯著相關(guān);AY493255，AY493342與半潛水長呈顯著相關(guān);AY493322與胸寬呈顯著相關(guān)。其余位點微衛(wèi)星與體重、體尺性狀之間的相關(guān)性均不顯著。

表2 16個微衛(wèi)星基因座的多態(tài)參數(shù)

表3 微衛(wèi)星位點的組分方差分析統(tǒng)計系數(shù)值 (F值)

3 討論

3.1 微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性

微衛(wèi)星應(yīng)用研究中，PIC是衡量片段多態(tài)性的指標(biāo)。按Bostein等提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.5的位點為高度多態(tài)信息含量指標(biāo)，0.25＜PIC＜0.5時為中度多態(tài)位點，當(dāng)PIC＜0.25時，為低度多態(tài)位點。本研究中16個微衛(wèi)星位點中，除 AY493285、AY587043和APL515883為中度多態(tài)外，其余13個微衛(wèi)星位點均呈現(xiàn)高度多態(tài)。

群體雜合度反應(yīng)了被檢測位點上群體的雜合子的頻率，是群體遺傳變異的一個適宜參數(shù)。群體平均雜合度的高低反映了群體的遺傳一致性程度。群體的雜合度越高，說明群體內(nèi)一致性差，群體變異大。本實驗結(jié)果表明，余姚番鴨的平均遺傳雜合度He為0.681，說明有著較高的遺傳多樣性。

3.2 微衛(wèi)星位點與體尺性狀的相關(guān)性

本實驗結(jié)果顯示，AY493314，AJ272582，AY493282和APL515883等標(biāo)記與特定性狀可能存在相關(guān)關(guān)系。這種相關(guān)性的發(fā)現(xiàn)對于選種、選配是有利的。實踐中選擇具有與優(yōu)良性狀相關(guān)標(biāo)記的個體留種，可以提高選種的準(zhǔn)確性，這也是標(biāo)記輔助選擇的主要目的之一。對這些微衛(wèi)星標(biāo)記間的連鎖分析研究，以及更加精確地進(jìn)行QTL定位，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大試驗鴨種范圍。如果一個群體的性狀差異顯著，或2個群體的差異很大，就可以通過標(biāo)記與性狀的相關(guān)分析，找出性狀與一個或多個標(biāo)記的遺傳相關(guān)，一旦發(fā)現(xiàn)顯著相關(guān)，即可認(rèn)為存在一個數(shù)量性狀位點，從而實現(xiàn)從表型到基因型選擇育種的轉(zhuǎn)變。

本實驗研究可為進(jìn)一步尋找有關(guān)番鴨生長性狀的QTLs及定位提供一定的理論數(shù)據(jù)。

［1］ 袁青妍，虞得兵，盧立志，等.靈昆雞群體微衛(wèi)星DNA遺傳多樣性研究 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，22(4):458-463.

［2］ Mukesh M，Sodh I M，Bhatia S，et al.Genetic diversity of Indian native cattle breeds as analysed with 20 microsatellite loci［J］.J Anima Breeding and Genet，2004，121:416-424.

［3］ Romanov M N，W eigend S.Analysis of genetic relationships between various populations of domesic and jungle fowlusing microsatellite markers［J］.Poultry Science，2001，80:1057-1063.

［4］ 任晉東，陶爭榮，盧立志，等.16個微衛(wèi)星基因多態(tài)性及其與紹興鴨開產(chǎn)體重的關(guān)聯(lián)分析 ［J］.中國畜牧雜志，2011，47(5):9-12.

［5］ 劉暢，張金玉，廉傳江，等.IGF-1調(diào)控區(qū)微衛(wèi)星座位遺傳多態(tài)性對松遼黑豬肉質(zhì)性狀的影響 ［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2010，30(1):119-122.

［6］ 王鵬，丁家桐，孫偉，等.湖羊GDF8區(qū)域微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳多樣性與生長性狀相關(guān)性分析 ［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(2):19-22.

［7］ 王建民，岳文斌，秦孜娟，等.綿羊微衛(wèi)星標(biāo)記與生長性狀的相關(guān)研究 ［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2007，38(11):1160-1167.

［8］ 段修軍，董飚，王日君，等.太湖鵝微衛(wèi)星標(biāo)記與體重的相關(guān)性 ［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，27(3):587-601.

［9］ 李馨，孫海濤，陳斌，等.興凱湖梅花鹿微衛(wèi)星遺傳多樣性與鮮茸重相關(guān)性分析 ［J］.中國畜牧雜志，2011，47(9):14-17.

［10］ 趙東偉，錢凱，吳旭，等.微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性與文昌雞蛋品質(zhì)性狀的相關(guān)分析 ［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2009，37(5):64-68.

［11］ Maak S， WimmersK， Weigend S， etal. Isolation and characterization of 18 microsatellites in the Peking duck and their application in other waterfowl species［J］.Mol Ecol Notes，2005(3):224-227.

［12］ Panlus K B， Tiedemann R. Ten polymorphic autosomal microsatellite loci for the Eider duck Somateria mollissima and their cross-species applicability among waterfowl species［J］.Mol Ecol Notes，2003(3):250-252.