原紅艷 張淑香 李興啟 李樹華

藥物性、噪聲性、缺血再灌注及老年性聽力損失均與活性氧（reactive oxygen species，ROS）密切相關(guān)［1～4］，ROS參與了耳蝸組織損傷及耳蝸毛細胞凋亡的過程。目前臨床上對這些感音神性聾的治療效果還不十分滿意，所用藥物多局限于改善局部血流，尚無針對自由基來進行治療的有效藥物，因此努力尋找高效低毒的天然抗氧化劑及設(shè)法調(diào)動或激活機體中的內(nèi)源性抗氧化劑至關(guān)重要。本研究旨在觀察抗氧化劑N－乙酰半胱氨酸（N－acetylcysteine，NAC）對外源性H2O2誘導(dǎo)的耳蝸毛細胞凋亡的抑制作用，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用新生1～5天SD 大鼠24只，購自中國人民解放軍總醫(yī)院實驗動物中心，雌雄不拘，樣本數(shù)以耳計。隨機分為4組，每組6只（12耳）：①無血清培養(yǎng)基組；②0.1mmol／L H2O2組（H2O2組）；③10mmol／L NAC組（NAC組）；④10mmol／L NAC＋0.1mmol／L H2O2組（NAC＋H2O2組）。

1.2 主要試劑與儀器 解剖顯微鏡：SZ3060型，奧林巴斯公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱：3548 型，美國FORMA 公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡：CX41－32RFL型，奧林巴斯公司產(chǎn)品；N－乙酰半胱氨酸（NAC）：Sigma A7250；無血清添加劑（Serum－Free supplement）：Sigma I－1884；丫啶橙（acridine orange，AO）；華美生物工程技術(shù)有限公司BS0043；碘化丙啶（propidium iodide，PI）；Sigma P－4170。

1.3 實驗方法

1.3.1 新生大鼠耳蝸Corti器的體外培養(yǎng) 將大鼠在－20℃環(huán)境下低溫麻醉3～5分鐘，待皮膚變白、不能活動后，浸于75%乙醇中消毒2分鐘后取出，眼科剪斷頭，剪開顱骨，去除腦組織，剪下顳骨，置于盛有PBS的培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺的解剖顯微鏡下分離出Corti器，并用尖刀按頂回、中回、底回將其分為3段。將分割好的組織片段移入盛有1ml無血清培養(yǎng)液（Serum－Free Medium）的培養(yǎng)皿中，并使其下沉到培養(yǎng)皿底部。最后將培養(yǎng)皿緩慢移入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。整個解剖過程必須迅速、準確，嚴格無菌操作。各組動物Corti器均在無血清培養(yǎng)液組培養(yǎng)24小時后，棄去原培養(yǎng)液，換入新的各組相對應(yīng)的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)期間在倒置顯微鏡下觀察基底膜Corti器的細胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)。

1.3.2 AO／PI雙重染色及凋亡細胞的檢測 吸干培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液，加入含100 mmol／L AO 及10 mmol／L PI的PBS（0.1 M ，pH 6.8）染色15分鐘，然后用PBS充分浸洗，再以4%多聚甲醛固定15～30分鐘，最后用PBS沖洗，甘油封固。

在熒光顯微鏡下觀察并攝像（熒光激發(fā)光波長360±10nm，發(fā)射光波長≥500nm）。經(jīng)AO／PI雙重染色后的基底膜，凋亡細胞被染為橙紅色，活性細胞則為亮綠色。在單位長度的顯微鏡攝影取景框范圍內(nèi)對耳蝸內(nèi)外毛細胞進行計數(shù)觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計軟件State 4.0 處理，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組耳蝸基底膜熒光顯微鏡觀察結(jié)果 無血清培養(yǎng)基組在48小時培養(yǎng)過程中毛細胞始終保持良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，在倒置顯微鏡下可以看到3排外毛細胞和1排內(nèi)毛細胞及其周圍的支持細胞，內(nèi)外毛細胞排列整齊，無壞死脫落，經(jīng)AO／PI染色后，內(nèi)、外毛細胞均被染成亮綠色，輪廓清晰，活性良好（圖1）。NAC 組耳蝸基底膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)與無血清培養(yǎng)基組無明顯差異，經(jīng)AO／PI染色后未見凋亡細胞（圖2）。H2O2組培養(yǎng)過程中，毛細胞基本保持原有排列規(guī)律，經(jīng)AO／PI染色后，可見大量凋亡細胞，細胞形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)水腫及碎裂，還有部分細胞缺失（圖3）。NAC＋H2O2組培養(yǎng)48小時后，細胞仍保持完好形態(tài)，染色后只見少許凋亡細胞（圖4）?？梢奛AC明顯減輕了H2O2對毛細胞的損傷程度。

2.2 各組毛細胞凋亡情況 無血清培養(yǎng)基組與NAC 組毛細胞凋亡率無顯著差異（P ＞0.05），H2O2組和NAC＋H2O2組凋亡率有顯著性差異（P＜0.05）（表1），說明NAC可明顯減輕H2O2對耳蝸毛細胞的損傷。

圖1 無血清培養(yǎng)基組耳蝸基底膜 經(jīng)AO／PI染色后，內(nèi)、外毛細胞均被染成亮綠色，輪廓清晰.（AO 和PI雙重染色）×200 圖2 NAC組耳蝸基底膜 內(nèi)、外毛細胞均被染成亮綠色，輪廓清晰，保持完好活性（AO 和PI雙重染色）×200 圖3 H2O2組耳蝸底回基底膜 可見大量凋亡細胞，被染成橙紅色（白箭頭所示），還有個別OHC 保持活性，被染成綠色（黑箭頭所示）（AO 和PI雙重染色）×200 圖4 NAC＋H2O2組耳蝸基底膜 經(jīng)AO／PI染色后，可見少許凋亡細胞（箭頭所示），大部分OHC、IHC保持良好活性（AO和PI雙重染色）×200

表1 各組耳蝸毛細胞凋亡情況（%，±s）

表1 各組耳蝸毛細胞凋亡情況（%，±s）

注：＊與H2O2 組比較，P＜0.05

組別底回中回頂回?zé)o血清培養(yǎng)基組0 0 0 H2O2組50.33±6.17 8.35±0.38 4.77±1.24 NAC組0.12±0.29 0.23±0.36 0 NAC＋H2O2組 4.45±2.38＊ 2.00±0.77＊ 0.12±0.29＊

3 討論

3.1 H2O2誘導(dǎo)的耳蝸毛細胞凋亡 大量研究證明ROS參與介導(dǎo)了細胞凋亡的過程。在耳蝸感覺細胞營養(yǎng)因子去除或順鉑引起的耳毒性過程中耳蝸內(nèi)ROS大量增加，這些自由基與毛細胞膜磷脂交互作用產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物，其中一些脂質(zhì)過氧化物作為聽神經(jīng)及毛細胞凋亡的介質(zhì)最終引起毛細胞凋亡［5］。在應(yīng)用慶大霉素等氨基糖苷類抗生素后，內(nèi)耳血流減少及隨后的再灌注損傷；噪聲暴露后基底膜過度振動導(dǎo)致局部組織機械損傷等，這些過程中均有大量自由基產(chǎn)生，清除自由基的酶及其代謝產(chǎn)物的消耗，均可誘導(dǎo)毛細胞的凋亡［1，6］。此外，多數(shù)研究認為，Ca2＋可促進細胞凋亡，胞漿內(nèi)Ca2＋濃度增加可作為細胞凋亡起始的早期信號［7］；而細胞內(nèi)游離Ca2＋濃度增高，一方面又會促使自由基增加進一步造成細胞的直接損害，另一方面也可能通過鈣調(diào)蛋白進一步激活蛋白激酶C，導(dǎo)致蛋白磷酸化，從而影響細胞的生長分化［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)H2O2組耳蝸基底膜有大量凋亡毛細胞，OHC 損傷最重，IHC次之，未見支持細胞凋亡，說明ROS促進了毛細胞的凋亡。

3.2 抗氧化劑NAC對H2O2誘導(dǎo)的耳蝸毛細胞凋亡的保護作用之機理 本實驗中NAC 組細胞凋亡率并無顯著變化，提示NAC 本身對細胞并無毒性作用，為臨床使用的安全性奠定了基礎(chǔ)。NAC 是一種含巰基化合物，主要用于治療充血性和阻塞性肺部疾患如慢性支氣管炎以及成人呼吸窘迫綜合征和急慢性炎癥［9］；它作為體內(nèi)活性氧系列物質(zhì)（如H2O2和O2－）的清除劑和還原型谷胱甘肽（GSH）的供給體，在機體抗氧化反應(yīng)中有重要作用［10，11］。GSH是細胞內(nèi)重要的保護性穩(wěn)定因素，它的抗氧化作用位置是在細胞內(nèi)，體內(nèi)具有將氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型谷胱甘肽（GSH）的酶系統(tǒng)，但隨活性氧濃度增加，體內(nèi)酶活性降低，因此補充外源性GSH 就顯得尤為重要。研究認為，NAC作為GSH 前體，在氧化應(yīng)激發(fā)生、GSH 下降時，NAC具有提高GSH 的作用［12］。

本實驗發(fā)現(xiàn)H2O2組耳蝸基底膜的細胞凋亡率較無血清培養(yǎng)基組顯著提高，而加入NAC 干預(yù)后，明顯抑制了H2O2的細胞毒性作用，表現(xiàn)為細胞凋亡率顯著下降，提示NAC 對耳蝸毛細胞具有保護作用，而且與其抗氧化能力有關(guān)。NAC 可對抗多種損傷導(dǎo)致的細胞凋亡［13～15］，NAC的保護機理有：①NAC可作為自由基的清除劑，干擾自由基的形成；②NAC的巰基作為H＋供體而發(fā)揮直接的抗氧化作用；③NAC 作為還原型GSH 的前體，富集于細胞環(huán)境中時可提供GSH 發(fā)揮抗氧自由基的作用。此外，NAC 還能再合成具有生物活性的GSH起間接抗氧化作用。另有證據(jù)表明，細胞凋亡的誘導(dǎo)和抑制與信號傳導(dǎo)通路有關(guān)，NAC可以干擾凋亡通路下游的信號［16］。

總之，NAC作為活性氧清除劑和GSH 前體，對活性氧誘導(dǎo)的毛細胞凋亡具有明顯的抑制作用。但關(guān)于NAC 的化學(xué)特性、生物學(xué)特性及其在體內(nèi)吸收和代謝環(huán)節(jié)、起始作用、靶細胞的作用位點及作用于大分子物質(zhì)的本質(zhì)還不十分明確，它能否應(yīng)用于人體對抗氧化應(yīng)激反應(yīng)還有待于進一步研究。

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