郭林娜

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院解剖教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

綠膿桿菌制劑（PA-MSHA）是用綠膿桿菌（甘露糖敏感性）菌毛株經(jīng)過培養(yǎng)、滅活、純化后磷酸鹽（PBS）緩沖液稀釋而成，其有效的藥理部位在于甘露糖結(jié)合蛋白的菌毛，能特異性地與高甘露糖表達(dá)型的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[1]。以往研究表明PA-MSHA改善人體的免疫狀況、對惡性腫瘤有輔助治療的作用[2-3]。本研究主要觀察PA-MSHA對肝細(xì)胞癌的體外殺傷作用，為進(jìn)一步研究殺傷機(jī)制提供依據(jù)，找到治療肝癌的新藥。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

人肝癌細(xì)胞BEL-7402由哈醫(yī)大一院中心實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI-1640培養(yǎng)基為美國Promega公司生產(chǎn)，使用前加小牛血清至10%，青霉素、鏈霉素至100 U/mL。酶聯(lián)免疫檢測儀（Safie2型）奧地利公司。透射電鏡（EM208S）荷蘭菲利普公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物處理及分組 PA-MSHA原液濃度為10×107/mL，將其生理鹽水稀釋成10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL、1.25×107/mL、0.631×107/mL、0.31×107/mL濃度組，稀釋倍數(shù)為兩倍，將各組稀釋的藥物作為MTT比色實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組，其中5×107/mL、2.5×107/mL兩組與肝癌細(xì)胞作用后，觀察兩組肝癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化觀察，各實(shí)驗(yàn)組藥物均用生理鹽水稀釋。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將復(fù)蘇后的肝癌細(xì)胞BEL-7402接種于在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液RPMI1640含10%小牛血清，100 U/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素，每2天換液傳代1次，觀察有90%以上細(xì)胞成單層貼壁生長，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT比色實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期人肝癌細(xì)胞BEL-7402并調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞懸液濃度為1×106/mL，將肝癌細(xì)胞加入96孔板，按每孔100μL種板，邊緣孔用無菌水填充，避免產(chǎn)生邊緣效應(yīng)。對照板加入100μL RPMI1640，在實(shí)驗(yàn)板中加入PA-MSHA的終濃度分別為10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL、1.25×107/mL、0.631×107/mL、0.31×107/mL。每孔設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別在37℃5%CO2條件下培養(yǎng)24 h之后每孔加入四甲基偶氮噻唑藍(lán)10μL（0.5%MTT，5 mg/mL），37℃5%CO2條件下培養(yǎng)4 h。離心吸掉上清液，每孔加入100μL二甲基亞砜（DMSO），置于低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 mm處測量各孔的吸光值（A值）。取5孔平均A值，同時(shí)計(jì)算出PA-MSHA對肝癌細(xì)胞的殺傷率和存活率。記錄結(jié)果，繪制細(xì)胞在不同藥物濃度下的細(xì)胞生長曲線。1.2.4透射電鏡及光鏡觀察 取對數(shù)生長期的細(xì)胞1×106/mL加入6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)蓋上蓋玻片，置于5%CO237℃條件下培養(yǎng)20 h，向孔內(nèi)滴入2.5×107/mL PA-MSHA作為實(shí)驗(yàn)組，對照組不加藥，實(shí)驗(yàn)組及對照組分別與細(xì)胞共同培養(yǎng)12、24、40 h，棄除培養(yǎng)液，置于EP管中，2 000 r/min離心15 min棄上清，立即用2.5%戊二醛固定2 h，加入4℃預(yù)冷的PBS液漂洗3次，每次10 min，再用1%四氧化鋨固定15 min，接著用PBS液漂洗3次。梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，固定包埋塊在超薄切片機(jī)上并切片。3%枸櫞酸鉛及醋酸鈾雙重染色，透射電子鏡觀察并拍片同時(shí)將作用24 h的實(shí)驗(yàn)組在電子顯微鏡下觀察及拍片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 12.0軟件分析所得數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

將濃度為2.5×107/mL的PA-MSHA與肝癌細(xì)胞BEL-7402培養(yǎng)24 h，與對照組同時(shí)置于顯微鏡下觀察：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞核固縮、細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，裂解的碎片被質(zhì)膜包繞，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為死亡的變化（圖1A）；觀察對照組肝癌細(xì)胞可見細(xì)胞形態(tài)飽滿、細(xì)胞膜完整光滑、細(xì)胞核完整呈圓形，少見死亡細(xì)胞（圖1B）。

圖1 肝癌細(xì)胞24 h細(xì)胞形態(tài)（×40）

2.2 MTT法檢測結(jié)果

將不同濃度的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)一定時(shí)間后檢測各組的平均OD值，用同樣的方法檢測對照組的平均OD值，根據(jù)OD值制圖（圖2），觀察圖2得出濃度為10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL的PA-MSHA對肝癌細(xì)胞BEL-7402的殺傷率與對照組比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 不同濃度PA-MSHA對BEL-7402生長的影響

2.3 透射電鏡觀察結(jié)果

透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化：實(shí)驗(yàn)對照組核膜、核仁完整，高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞器完整清晰；一定濃度的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)12、24 h后肝癌細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、體積變小、變圓，細(xì)胞內(nèi)可見空泡結(jié)構(gòu)，核染色質(zhì)凝聚、邊緣化，細(xì)胞核裂解成有膜包裹的碎塊，細(xì)胞膜包繞著一部分細(xì)胞器即凋亡小體形成；一定濃度的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)40 h時(shí)肝癌細(xì)胞體積變大，線粒體內(nèi)腔擴(kuò)大，細(xì)胞核濃縮邊集、核碎裂、核溶解，表現(xiàn)為壞死的細(xì)胞特征。見圖3～5。

圖3 對照組肝癌細(xì)胞BEL-7402 12 h電鏡下細(xì)胞形態(tài)

圖4 實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞BEL-7402 12 h電鏡下細(xì)胞形態(tài)

圖5 實(shí)驗(yàn)組肝癌細(xì)胞BEL-7402 40 h電鏡下細(xì)胞形態(tài)

3 討論

目前認(rèn)為惡性腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖異常、細(xì)胞凋亡下降有密切的關(guān)系，同時(shí)決定腫瘤生長速度[4]。因此，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡將成為腫瘤治療的新方向。PA-MSHA能特異性地與高甘露糖表達(dá)型的腫瘤細(xì)胞結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[1]，且國內(nèi)也有報(bào)道[5-7]，PA-MSHA在肺癌、膀胱癌、宮頸癌等惡性腫瘤的治療中起到良好的效果。肝癌發(fā)病率為癌癥中第6位，病死率第3位[8]，惡性程度高，治療效果差，尋找高效的治療藥物已經(jīng)提上日程。

本研究將不同濃度的PA-MSHA與肝癌細(xì)胞BEL-7402在體外培養(yǎng)，通過電子顯微鏡對細(xì)胞形態(tài)變化的觀察，初步發(fā)現(xiàn)PA-MSHA對肝癌細(xì)胞BEL-7402有殺傷作用。進(jìn)一步采用MTT檢測不同濃度的PA-MSHA對肝癌細(xì)胞BEL-7402的殺傷效應(yīng)，最后利用透射電鏡確定PA-MSHA對肝癌細(xì)胞BEL-7402的殺傷機(jī)制。MTT實(shí)驗(yàn)證明，PA-MSHA對肝癌細(xì)胞的殺傷效應(yīng)非常明顯，此殺傷效用隨著濃度的增大而增強(qiáng)表現(xiàn)為量效關(guān)系，在濃度較低時(shí)，與對照組相比較對肝癌細(xì)胞BEL-7402殺傷作用沒有顯著性差異，當(dāng)藥物濃度達(dá)到10×107/mL、5×107/mL、2.5×107/mL時(shí)，藥 物 對 肝 癌 細(xì) 胞BEL-7402的殺傷效用差異顯著（P＜0.01）；透射電鏡觀察結(jié)果表明：肝癌細(xì)胞于12、24 h表現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)特征：肝癌細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、體積變小、變圓，細(xì)胞內(nèi)可見空泡結(jié)構(gòu)，核染色質(zhì)凝聚、邊緣化，細(xì)胞核裂解成有膜包裹的碎塊，細(xì)胞膜包繞著一部分細(xì)胞器即凋亡小體形成；肝癌細(xì)胞于40 h發(fā)生凋亡與壞死共存的現(xiàn)象，但以細(xì)胞壞死形態(tài)變化為主：肝癌細(xì)胞體積變大，線粒體內(nèi)腔擴(kuò)大，細(xì)胞核濃縮邊集、核碎裂、核溶解，表現(xiàn)為壞死的細(xì)胞特征?？梢姡琍A-MSHA對肝癌細(xì)胞BEL-7402有殺傷作用，表現(xiàn)為與濃度相關(guān)的量效關(guān)系，殺傷效應(yīng)是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與壞死而實(shí)現(xiàn)的。其對肝癌的治療有著非常高的研究價(jià)值，同時(shí)也可能成為抗腫瘤生長的潛在性藥物，寄希望于進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)而指導(dǎo)臨床工作，最終，使腫瘤患者生命延長。

綜上所述，PA-MSHA對人肝癌細(xì)胞BEL-7402有很強(qiáng)的殺傷作用，發(fā)揮殺傷效用的機(jī)制初步認(rèn)為是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死。

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