董衛(wèi)國,陳采益,林嵐,王豐,謝永財,陳躍

(1.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院,福州 350108;2.福建中醫(yī)藥大學針灸學院,福州 350108)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種以進行性認知功能障礙和記憶損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD好發(fā)于60歲以后的老年人,隨著人口老齡化日益嚴重,AD發(fā)病率呈上升趨勢[1]。但其病因及發(fā)病機制尚不十分清楚,目前沒有特效治療或逆轉疾病進展的藥物。針灸治療AD具有多途徑、多水平、多方式、多靶點的作用特點,而且療效可靠,副反應少,越來越顯示出其獨特優(yōu)勢[2-4]。大量的證據(jù)表明,能量代謝障礙及線粒體結構及功能失調與 AD關系密切[5],而線粒體形態(tài)結構和功能的變化是導致 AD能量代謝障礙的重要因素和關鍵環(huán)節(jié)。本實驗擬通過觀察電針對快速老化小鼠亞系(senescence accelerated mouse/prone 8,SAMP8)海馬神經(jīng)元線粒體呼吸鏈酶復合體活性的影響,從線粒體功能角度進一步揭示針灸治療AD的作用機制,為臨床上針灸防治AD提供更充分的實驗理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8月齡SAMP8小鼠16只,8月齡抗快速老化小鼠亞系(senescence accelerated mouse/resistance1,SAMR1)8只,均為雄性,體重20～25 g,均由北京維通利華實驗動物科技有限公司提供[實驗動物質量合格證編號scxk(京)2002-0001]。

1.2 主要儀器及試劑

毫針(華佗牌無菌針灸針,規(guī)格 0.25 mm×15 mm),G6805電針治療儀(上海醫(yī)療儀器廠),Morris水迷宮系統(tǒng)(中國醫(yī)學科學院藥物研究所),解剖顯微鏡(日本 Olympus公司),紫外分光光度計(Varian,美國),高效液相色譜儀系統(tǒng)(Waterz,美國)。提取及檢測線粒體呼吸鏈酶復合體試劑,泛醌、氧化型 NADH、細胞色素C、抗霉素、EDTA、EGTA、DNA酶、Hepes、魚藤酮、牛血清白蛋白(BSA)等均購自美國Sigma公司。

1.3 動物分組及治療

動物在實驗前適應性喂養(yǎng)1星期。采用計算機隨機的方法將SAMP8鼠隨機分為模型組、電針組,每組8只;SAMR1小鼠8只作為正常老化對照組。

電針組采用自制固定器固定小鼠,選擇百會、大椎、腎俞(雙側)及太溪(雙側)進行電針治療。具體方法為,直刺進針后,接G6805型電針治療儀,選連續(xù)波,頻率 2 Hz,電流強度以引起小鼠后肢肌肉輕微抖動而不嘶叫為宜,每次20 min,每日1次, 10 d為1個療程,療程間隔1 d進行下1個療程,共3個療程,計30 d。模型組和對照組不作治療,只進行相同方式、相同時間和相同程度的抓取和小鼠固定器固定。

1.4 Morris水迷宮試驗

采用 Morris水迷宮試驗檢測小鼠的空間學習記憶能力,測試內容包括定位航行試驗和空間探索試驗2部分。定位航行試驗中,平臺位于第3象限,沒于水下1 cm,每天分上、下午兩個時間段,每個時間段每鼠訓練4次,將小鼠分別從4個入水點(各象限池壁中點)面向桶壁放入水中,記錄小鼠爬上平臺所需時間,即逃避潛伏期,如果90 s內未找到平臺則將其引至平臺并在平臺停留 10 s,記錄逃避潛伏期為 90 s,連續(xù)進行5 d。第6天撤離平臺,進行空間探索試驗,將小鼠從平臺所在象限的對側象限放入池中,自由游泳60 s后結束試驗,記錄小鼠在原平臺象限停留的時間。

1.5 動物處理

水迷宮檢測結束后,快速斷頭取腦,在冰浴上分離出完整海馬,存放于－80℃冰箱,用于檢測線粒體呼吸鏈酶復合體活性。

1.6 小鼠海馬線粒體制備

整個制備過程均在0～4℃下進行。將取出的海馬,稱重,按 9:1(W/V)加入勻漿緩沖液(甘露醇210 mmol/L,蔗糖 70 mmol/L,三羥甲基胺基甲烷8 mmol/L,EGTA 1 mmol/L,pH 7.5)。勻漿 15次,于1300 g離心10 min,吸出上清液,將沉淀再次勻漿,離心后合并2次上清液,于1300 ×g離心10 min,收集上清液,于17000 ×g離心15 min,沉淀用勻漿緩沖液清洗2次,重懸于勻漿緩沖液中;以牛血清白蛋白為標準,采用Lowry法測定線粒體蛋白濃度,將其濃度調至200 μg/mL。

1.7 線粒體呼吸鏈酶活性測定

線粒體呼吸鏈酶復合體活性檢測參照 Vyatlina的方法及結合我們以前的方法[6-7],用紫外分光光度法測定線粒體呼吸鏈復合體活性,將 10～20 μg的線粒體蛋白加入到終體積為2 mL的緩沖液中,以蒸餾水作空白管,校正光密度到0點,在30℃條件下,測定一定波長處 3 min內光吸收值的變化。酶活性單位為nmol/min/mg protein。

1.7.1 線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ活性測定

將線粒體與 10 mM Tris- HCl(pH8.0)緩沖液、80 μmol/L泛醌、1 mg/mL BSA、0.25 mM鐵氰化鉀、和0.4 μmol/L抗霉素A混合后,加入200 μM NADH啟動反應。連續(xù)測定340 nm處NADH吸收值的變化(NADH的消光系數(shù)ε=5.5 mmol/L－1cm－1)。

1.7.2 線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅱ活性測定

將線粒體蛋白加入到復合物Ⅱ反應緩沖液內,混勻后加入20 μM琥珀酸鹽啟動反應。連續(xù)測定600 nm處 2,6-二氯靛酚鈉鹽水合物(DCPIP)吸收值的變化(DCPIP 的消光系數(shù)ε=19.1 mmol/L－1cm－1)。反應緩沖液含 50 mmol/L磷酸鹽、pH 7.4,50 μmol/L 2,6-二氯靛酚鈉鹽水合物、2 mmol/L鐵氰化鉀、2 μg/mL魚藤酮、2 μg/mL抗霉素A、25 μmol/L泛醌。

1.7.3 線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅲ活性測定

將線粒體組分加入到線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ緩沖液內,混勻后加入 80 μM還原型泛醌(DBH2)(以二硫蘇糖醇還原)啟動反應。連續(xù)測定550 nm處細胞色素C吸收值的變化(細胞色素C的消光系數(shù)ε=19.0 mmol/L－1cm－1)。反應緩沖液包括線粒體分離液、50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4、1 mmol/L EDTA、250 mmol/L蔗糖、2 mmol/L鐵氰化鉀、50 μmol/L氧化型細胞色素C。

1.7.4 線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅳ活性測定

將線粒體蛋白加入到復合體Ⅳ反應緩沖液內,混勻后測定550 nm處細胞色素C吸光度變化3 min(細胞色素C的消光系數(shù)ε=19.0 mmol/L－1cm－1),即為細胞色素C氧化酶活性。緩沖液含線粒體分離液、10 mmol/L Tris-HCl pH 7.0,25 mmol/L蔗糖,120 mmol/L氯化鉀,0.025%十二烷基β-D-麥芽糖苷,50 μmol/L還原型細胞色素 C。

1.8 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)以均值±標準差形式表示,采用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學分析。定位航行試驗采用重復測量數(shù)據(jù)方差分析,線粒體呼吸鏈酶復合體活性采用單因素方差分析(one way ANOVA),如差異有統(tǒng)計學意義,則用 LSD(least significant difference)法進行組間兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠逃避潛伏期比較

5 d的定位航行試驗中,SAMR1對照組的逃避潛伏期明顯短于SAMP8模型組(P＜0.05或P＜0.01),說明同一種系的正常老化小鼠學習記憶能力比快速老化小鼠強。與模型組比較,電針組平均逃避潛伏期縮短(P＜0.05或P＜0.01),并且第5天電針組平均逃避潛伏期接近對照組,提示電針能改善快速老化鼠的學習記憶能力。詳見表1。

表1 各組小鼠平均逃避潛伏期比較 (±s,s)

表1 各組小鼠平均逃避潛伏期比較 (±s,s)

注:與模型組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天對照組 8 50.3±8.82) 45.7±5.92) 37.9±9.62) 30.1±7.11) 24.2±5.21)模型組 8 71.4±10.4 65.8±8.6 58.1±7.7 45.2±6.9 37.2±9.5電針組 8 64.9±6.21) 55.3±9.12) 46.1±7.31) 38.2±6.52) 29.1±8.72)

2.2 各組小鼠在原平臺象限停留時間的比較

表2 各組小鼠在原平臺象限停留時間的比較 (±s,s)

表2 各組小鼠在原平臺象限停留時間的比較 (±s,s)

注:與模型組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01

組別 n 停留時間對照組 8 25.1±5.42)模型組 8 10.2±4.3電針組 8 17.3±6.21)

小鼠在原平臺象限游泳時間越長,反映小鼠對原平臺象限的記憶越好。模型組與 SAMR1對照組相比,時間明顯縮短(P＜0.01)。電針組時間較模型組延長(P＜0.05),與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表2。

2.3 各組小鼠海馬線粒體呼吸鏈酶復合體活性比較

對照組海馬線粒體呼吸鏈酶復合體(復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)活性均較模型組明顯增高(P＜0.01)。電針組海馬線粒體呼吸鏈酶復合體(復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)活性均較模型組明顯升高(P＜0.05)。電針組海馬線粒體呼吸鏈酶復合體(復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)活性與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠海馬線粒體呼吸鏈酶復合體活性比較(±s,nmol/min/mg protein)

表3 各組小鼠海馬線粒體呼吸鏈酶復合體活性比較(±s,nmol/min/mg protein)

注:與模型組比較1)P＜0.05,2)P＜0.01

組別 n 復合體Ⅰ 復合體Ⅱ 復合體Ⅲ 復合體Ⅳ對照組 8 15.15±2.132) 72.76±6.282) 49.92±3.912) 60.64±4.292)模型組 8 10.22±1.41 50.07±5.65 35.63±3.57 43.37±3.71電針組 8 12.76±2.311) 61.01±3.982) 44.56±4.531) 52.67±2.921)

3 討論

線粒體是具有雙層生物膜的細胞器,其主要功能是氧化代謝產(chǎn)物,并將產(chǎn)生的能量轉化為 ATP,為機體提供能量。線粒體呼吸鏈酶復合體是位于線粒體內膜上與氧化磷酸化有關的蛋白質,主要包括復合體Ⅰ(NADH脫氫酶復合體),復合體Ⅱ(琥珀酸脫氫酶復合體),復合體Ⅲ(細胞色素還原酶復合體)及復合體Ⅳ(細胞色素氧化酶復合體)。線粒體呼吸鏈復合體活性能直接或間接反映線粒體的呼吸功能狀況[8]。大量研究表明,AD的發(fā)生與線粒體密切相關,AD患者腦組織活檢可見線粒體腫脹及數(shù)目減少[9]、DNA突變等形態(tài)結構的改變,還觀察到線粒體膜電位降低,酶活性降低,ATP合成減少等功能異常。我們前期體外的研究結果也表明,β-淀粉樣蛋白(β-Amyloid Protein,Aβ)誘導體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元 AD模型可見線粒體呼吸鏈酶復合體活性降低,ATP含量減少[7]。這進一步說明了線粒體及線粒體呼吸鏈與AD的密切關系。本實驗結果顯示,與SAMP1對照組比較,SAMP8模型組海馬線粒體呼吸鏈酶復合體活性降低。

SAMP8小鼠是由日本東京都大學竹田教授培育成功[10],SAMP8亞系的特征是中樞學習記憶功能隨增齡進行性快速衰退[11]。研究表明,SAMP8腦內具有多種與AD類似的病理變化[12],因此,SAMP8小鼠被認為是一種相對較為完善的AD模型,已應用于AD的研究。所以,本實驗中我們選擇SAMP8作為AD動物模型進行研究。

Morris水迷宮是檢測小鼠空間學習記憶的常用裝置。定位航行試驗檢測小鼠的學習能力,而空間探索試驗用來判斷其近期記憶能力。通過實驗發(fā)現(xiàn),電針組潛伏期較模型組縮短,時間增加,表明電針可提高 AD模型小鼠的學習記憶能力,這與以前報道的結果一致。

已有學者研究報道,電針可減輕 SAMP8鼠海馬神經(jīng)元線粒體超微結構的損傷及提高線粒體細胞色素 C氧化酶活力[13-15],表明電針對線粒體的結構和功能都有保護作用。本實驗從線粒體呼吸鏈酶復合體角度探討電針治療 AD的作用機制,其結果表明,電針能明顯提高線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性,進一步證實了電針對線粒體功能的保護作用。由此,我們推測電針治療 AD的機制可能是提高線粒體呼吸鏈酶復合體活性,從而改善線粒體功能及能量代謝。

[1] Walsh DM, Selkoe DJ. Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer's disease[J]. Neuron, 2004,44(1):181-193.

[2] 岳進,聶慧,李榮華.針灸治療老年性癡呆的神經(jīng)生物機制實驗研究進展[J].上海針灸雜志,2009,28(3):183-185.

[3] Cheng H, Yu J, Jiang Z,et al. Acupuncture improves cognitive deficits and regulates the brain cell proliferation of SAMP8 mice[J].Neurosci Lett, 2008,432(2):111-116.

[4] Meng PY, Sun GJ, Mao JJ,et al. Effect of Electroacupuncture on Learning and Memory in Rats with Vascular Dementia[J]. J Acupunct Tuina Sci, 2012, 10(2):67-71.

[5] Moreira PI, Cardoso SM, Santos MS,et al. The key role of mitochondria in Alzheimer’s disease[J]. J Alzheimers Dis, 2006,9(2):101-110.

[6] Vyatkina G, Bhatia V, Gerstner A,et al. Impaired mitochondrial respiratory chain and bioenergetics during chagasic cardiomyopathy development[J]. Biochim Biophys Acta, 2004,1689(2):162-173.

[7] Dong W G, Huang F, Fan W G,et al. Differential effects of melatonin on amyloid-beta peptide 25-35-induced mitochondrial dysfunction in hippocampal neurons at different stages of culture[J]. J. Pineal Res, 2010,48(2):117-125.

[8] Rustin P, Chretien D, Bourgeron T,et al. Biochemical and molecular investigations in respiratory chain deficiencies[J]. Clin Chim Acta,1994,228(1):35-51.

[9] Hirai K, Aliev G, Nunomura A,et al. Mitochondrial abnormalities in Alzheimer’s disease[J]. J Neurosci, 2001,21(9):3017-3023.

[10] Takeda T, Hosokawa M, Takeshita S,et al. A new murine model of accelerated senescence[J]. Mech Ageing Dev, 1981,17(2):183-194.

[11] Takeda T. Senescence-accelerated mouse (SAM): a biogerontological resource in aging research[J]. Neurobiol Aging, 1999,20(2):105-110.

[12] Chen J, Zhou Y, Mueller-Steiner S,et al. SIRT1 protects against microglia-dependent amyloid-beta toxicity through inhibiting NF-kappaB signaling[J]. J Biol Chem, 2005,280(48):40364-40374.

[13] 彭靜,曾芳,何宇恒,等.電針對SAMP8小鼠海馬線粒體作用的研究[J].針刺研究,2007,32(6):364-367.

[14] 曾芳,何宇恒,彭靜,等.電針對SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元線粒體超微結構的影響[J].上海針灸雜志,2008,27(5):41-43.

[15] 何宇恒,曾芳,余曙光.電針對 SAMP8小鼠海馬神經(jīng)元線粒體超微結構及相關凋亡蛋白的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2008,35(10):160 0-1602.