李 琴

(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院 寧夏銀川 750021)

p16是一種抑癌基因，其編碼的蛋白可與cycline-D1競爭性結(jié)合CDK4，從而抑制CDK4。Cycline-D1激酶的催化活性，抑制pRb蛋白的磷酸化，使其不能釋放E2F因子，細胞分裂不能通過G1-S調(diào)控點，阻止細胞無限增殖［1］。人類多種腫瘤中都發(fā)現(xiàn)存在p16基因異常。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)目前被認為是宮頸癌的致瘤病毒，其編碼的E6、E7蛋白可與p53等多種抑癌基因結(jié)合使其失活，導致細胞異常增生。外陰惡性腫瘤發(fā)病率較低，近年來也有上升趨勢，多數(shù)為外陰鱗狀細胞癌(vulvar squamous cell cancer，VSCC)，外陰疣狀癌和基底細胞癌較少。疣狀癌雖為鱗癌的特殊亞型，但其臨床特點與基底細胞癌相似。本研究探討正常外陰皮膚、外陰鱗癌、外陰基底細胞癌及疣狀癌中p16基因的表達缺失與HPV感染的情況，旨在探討其間關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取我院婦科1990～2009年門診活檢及手術(shù)切除，經(jīng)病理證實為外陰癌的石蠟標本88例，其中VSCC48例，基底細胞癌20例，疣狀癌20例及正常外陰皮膚20例。DNA提取試劑盒;p16引物:上游5＇-cctggetetgaccattetgt-3;下游5-gtectcacetgagggacctt-3［2］;HPV16 引物:上游 5＇-ggcttttgacagttaataca-3;下游5-attagtgattatagaeatta-3(購自上海生工試劑公司)。PCR反應(yīng)試劑盒(購自大連寶生物試劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取。石蠟切片10um5～7片約25mg置入1.5mL PCR試管中，加二甲苯1mL水浴60℃30 min，3 000 r/min離心10 min后去上清，重復一次以除去石蠟。后加入無水乙醇1mL充分振蕩，3 000r/min離心10 min后去上清，重復1次以脫水及殘存的二甲苯。室溫放置10 min揮發(fā)殘余的乙醇后，按照DNA提取試劑盒說明書進行。

1.2.2 PCR擴增。將DNA提取液即模版3μL加入到按照試劑盒說明配置的25μL反應(yīng)體系內(nèi)，含上下游引物各1μL(濃度為25pmol/L)。擴增程序為:p16 94℃60s、55℃45s、72℃30s 共 30個循環(huán)后72℃延伸10min，產(chǎn)物為347bp;HPV16 94℃60s、55℃60s、72℃90s共30個循環(huán)后72℃延伸5min，產(chǎn)物為335bp;βactin內(nèi)對照無特異程序，產(chǎn)物為250 bp。陽性對照應(yīng)用已知p16陽性的正常皮膚組織DNA模板和HPV陽性的宮頸癌DNA模板代替樣本模板;陰性對照應(yīng)用DEPC處理的雙蒸水代替樣本模板。

1.2.3 產(chǎn)物判定。向25μL產(chǎn)物內(nèi)加入3μL Loading buffer(上樣緩沖液)混勻，取出15μL加入含EB的2%瓊脂糖凝膠孔中進行電泳，40 min后于紫外燈下進行觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學處理 計算基因陽性表達率，并進行比較，按χ2檢驗行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 p16和HPV16在外陰癌及癌前病變中的檢測情況

2.1.1 p16基因的陽性表達率。外陰正常皮膚中p16基因的陽性表達率為100%，在VSCC中p16基因的陽性表達率為27.08%，相比差異有顯著性(P＜0.05)。基底細胞癌和疣狀癌中未檢出p16基因。見表1。

2.1.2 HPV16 DNA的陽性表達率。外陰正常皮膚中未檢出HPV16 DNA，在基底細胞癌中為85%，疣狀癌中為90%，在VSCC中未檢出HPV16 DNA。見表1。

表1 p16基因、HPV16的檢出情況(例)

2.2 p16與VSCC臨床病理特征的關(guān)系 p16基因表達與臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異均有顯著性(P＜0.05)。見表2。

表2 p16基因陽性表達率與VSCC臨床病理特征的關(guān)系(例)

3 討論

p16基因的抑癌作用在于它抑制了CDK4，影響細胞從G1-S期的轉(zhuǎn)變，使細胞停留在G1期［3］。本研究從正常皮膚到VSCC，p16基因陽性表達率明顯降低，提示外陰鱗狀上皮細胞出現(xiàn)異型性時，就有p16基因的部分表達缺失，當細胞發(fā)生癌變時，p16基因表達缺失明顯增加。說明VSCC與p16基因表達缺失有關(guān)。在基底細胞癌和疣狀癌中未檢出p16基因，可能p16基因幾乎全部表達缺失，這兩種癌與p16基因表達缺失關(guān)系更密切。HPV與宮頸癌發(fā)生的關(guān)系已經(jīng)明確，但與外陰癌變的關(guān)系尚不能肯定。因此，本研究擬在探討HPV感染是否與外陰癌變有關(guān)。研究中發(fā)現(xiàn)正常皮膚中未檢出HPV感染，HPV16在VSCC未檢出，但基底細胞癌和疣狀癌中的HPV陽性表達率分別為85%和90%，提示它們與HPV感染有關(guān)。

研究中還發(fā)現(xiàn)，在VSCC中，Ⅲ～Ⅳ期癌較I～Ⅱ期癌p16基因的表達缺失率高，中、低分化較高分化高，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的較無轉(zhuǎn)移高，提示隨著腫瘤的臨床分期增加、分化程度降低和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，p16基因表達缺失率明顯增加，p16基因的表達缺失在外陰癌的發(fā)展過程中也起到重要的作用，與腫瘤的惡性進展有關(guān)。這與HELGAB［4］等在子宮內(nèi)膜癌等其他惡性腫瘤中p16基因表達缺失的報道一致。

在基底細胞癌和疣狀癌中，p16基因全部表達缺失，HPV感染的陽性率均非常高，進一步提示HPV感染在基底細胞癌和疣狀癌中可能導致了p16基因表達缺失。然而，此結(jié)論與以往應(yīng)用免疫組化方法研究的結(jié)論不一致，在與HPV有關(guān)的惡性腫瘤中，如口腔疣狀癌和宮頸鱗狀細胞癌［5］，p16蛋白往往呈過表達。但p16蛋白的過度表達可能無抑癌活性，一方面p16的正常抑癌活性往往需要pRb正常功能的存在，而HPV的E7可使pRb失去正常的功能或使之降解;另一方面RUHUL［6］等發(fā)現(xiàn)HPV感染后，p16蛋白雖過度表達但其功能及結(jié)構(gòu)已發(fā)生改變，可能與p16基因的甲基化和突變有關(guān)。所以，HPV16的感染與p16基因的表達缺失在癌變的過程中可能有協(xié)同作用，但其具體機制和作用關(guān)系還需進一步探討。

［1］LUKAS J，AAGAARD L，STRAUSS M，et a1.Oncogenic aberrations of p16 ink4/CDKN2 and cyelinD1 cooperate to deregulate G1 control［J］.CancerRes，1995，55(21):4818

［2］李福才，李英慧，趙 旭.喉癌中p15、p16基因純合缺失與EGFR基因擴增相關(guān)性研究［J］.遺傳學報，2004，31(2):109

［3］SERRANO M，HANNON GT，REACH D.A new regulatory motify in cell cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4［J］.Nature，1993，366(6456):704

［4］HELGAB S，SOMA D，LARS A.Loss of nuclear p16 protein expression is not associated with promoter methylation but defines a subgroup of aggressive endometrial carcinomas with poor prognosis［J］.Clin Cancer Res，2000，6(8):153

［5］鄒 萍，唐瞻貴，馮德云.人乳頭狀瘤病毒16/18型、p53、p16蛋白在口腔疣狀癌中的表達［J］.口腔頜面外科雜志，2003，13(3):211

［6］RUHUL QUDDUS M，XU C，STEINHOFF MM，et a1.Simplex(differentiated)type VIN:absence of p16 INK4 supports its weak association with HPV and its probable precursor role in non-HPV related vulvar squamous cancers［J］.Histopathology，2005，46(6):718