羅奮棋 徐杰

脊髓損傷后，神經(jīng)細(xì)胞增生肥大，胞漿呈嗜酸性，突起變粗，分支增多。這些改變可起到減輕損傷及填補(bǔ)組織損傷而形成的空洞等作用，為神經(jīng)再生創(chuàng)造條件；但聚集的星形膠質(zhì)細(xì)胞所形成的膠質(zhì)性瘢痕及其所分泌和表達(dá)的抑制性因子形成機(jī)械及化學(xué)屏障對(duì)上下行神經(jīng)元軸突的再生有明顯的阻礙作用[1]。N2末端為甘氨酰2脯氨酰的肽鍵能被GDPA特異地水解，而該肽鍵正是構(gòu)成膠質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)[2]，因此，推測(cè)GPDA在緩解星形膠質(zhì)細(xì)胞所構(gòu)成的機(jī)械和化學(xué)屏障中起到作用，從而改善脊髓繼發(fā)性損傷的進(jìn)一步發(fā)展。本文對(duì)GDPA基因在多種情況下表達(dá)的變化進(jìn)行研究，并探討脊髓損傷早期，GDPA對(duì)繼發(fā)性脊髓損傷的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 Sprague-Dawley大鼠（中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，10周齡）36只，體重180～240g。根據(jù)隨機(jī)表分為三組。假手術(shù)組、脊髓損傷未使用藥物干預(yù)組（創(chuàng)傷組）、脊髓損傷+甲強(qiáng)龍干預(yù)組 （甲強(qiáng)龍組）。每組12只。在大鼠脊髓損傷后24 h將損傷的脊髓組織切取，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)。檢測(cè)GDPA的表達(dá)。

1.2 手術(shù)方法 腹部消毒后腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，腰背部備皮消毒，充分暴露T8～9脊髓腰膨大。采用改良的Allen打擊法（5 g×5 cm）制作脊髓損傷模型，甲強(qiáng)龍組大鼠靜脈注射甲基強(qiáng)的松龍（30 mg/kg），假手術(shù)組未做任何處理關(guān)閉切口，創(chuàng)傷組大鼠靜脈內(nèi)注射等量的0.9%氯化鈉溶液。24 h后切除脊髓損傷部位上下1 cm的脊髓組織切取，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)

1.3.1 脊髓神經(jīng)細(xì)胞總的RNA使用Trizol液提取 1 ml Trizol液中加入1 g組織，反復(fù)吹打數(shù)次?；旌暇鶆蚝蠹尤?.2 ml氯仿，并予以離心（12 500 r/min，10 min）。吸取上部清液，加入0.5 ml異丙醇，離心（12 500 r/min，10 min）。沉淀物加入30 μl DEPC溶化。

1.3.2 RNA定量和鑒定 紫外分光光度計(jì)定量RNA，計(jì)算OD260、OD280及比值。取總RNA3 μg，電泳（瓊脂糖凝膠）30 min，使用紫外光顯示28 s及18 s兩條rRNA帶，說明RNA提取完整性好。

1.3.3 以Vector NTI Suite軟件設(shè)計(jì)檢測(cè)引物 引物序列：正義：5’TTGCGTGCTGCTATAGTGG 3’，反義：5’ ACTGCGCCACGAATTTGGG 3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長度：254bp。β-Actin檢測(cè)引物序列如下：正義：5’ GGGCAATGG TCAGTAGGAT 3’（176-196），反義：5’ CAGTGTGTGACGAG TCCGT 3’（277-257）。擴(kuò)增長度為 264 bp。

1.3.4 用One-tube RT-PCR system（Roche公司）進(jìn)行一步法反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。

1.4 取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳，掃描DNA密度，分析基因表達(dá)的相對(duì)豐度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶mRNA的RT-PCR結(jié)果

2 結(jié)果

假手術(shù)組GDPA的mRNA的表達(dá)的相對(duì)豐度為1.5403±0.1604；脊髓損傷24 h后創(chuàng)傷組GDPA的表達(dá)的相對(duì)豐度為0.5994±0.3414，與假手術(shù)組相比差異有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；GDPA在脊髓損傷后使用甲強(qiáng)龍干預(yù)組中的表達(dá)相對(duì)豐度為1.8432±0.1294，與創(chuàng)傷組比較差異有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。表明大劑量甲基強(qiáng)的松龍的早期使用能促進(jìn)脊髓損傷后甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表達(dá)恢復(fù)，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。（表1，圖1）。β-Actin的RT-PCR結(jié)果見圖2，甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶mRNA的RT-PCR結(jié)果見圖3。

表1 脊髓損傷后24 h二肽氨基肽酶表達(dá)情況（±s）

表1 脊髓損傷后24 h二肽氨基肽酶表達(dá)情況（±s）

圖1 GPDA表達(dá)的相對(duì)豐度

圖2 β-Actin的RT-PCR結(jié)果

3 討論

外傷后脊髓的功能完全恢復(fù)的可能性是比較小的，在受到外傷后很短時(shí)間內(nèi)就會(huì)發(fā)生繼發(fā)性的損傷，所以給予早期保護(hù)治療非常的重要。甲基強(qiáng)地松龍為激素類藥物，其可對(duì)此疾病進(jìn)行治療，現(xiàn)今多應(yīng)用于急性脊髓損傷的早期治療。

早在1966年，Hopsu-Havu等[3]發(fā)現(xiàn)甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶。而后多位專家經(jīng)過分析證明了該酶的活性[4]。為了探索其他哺乳動(dòng)物組織中是否含有此酶， 他們首先以鼠肝為樣品進(jìn)行了研究，同樣證實(shí)在鼠肝和鼠腎中都存在這種新的二肽氨基肽酶，即現(xiàn)在所稱的GPDA[5-6]。

文中建立的模型應(yīng)用打擊法，造成模型脊髓損傷，此模型和人體受到外傷的情況比較相似，相關(guān)性比較好。本研究發(fā)現(xiàn)脊髓組織有甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表達(dá)，脊髓損傷24 h后，甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表達(dá)顯著降低，大劑量甲基強(qiáng)的松龍能促進(jìn)甘氨酸脯氨酸二肽氨基肽酶的表達(dá)，到達(dá)治療效果。

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