張迎，劉軍海，*，劉燕飛，李燕，柳仁民

（1.聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252059；2.聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山東 聊城 252059）

莽草酸又稱(chēng)毒八角酸，學(xué)名為3，4，5-三羥基-1-環(huán)己烯-1-羧酸（3，4，5-trihydroxy-1-cyclohexene-1-carboxylic acid），結(jié)構(gòu)式相對(duì)分子質(zhì)量為174.15。莽草酸為白色精細(xì)粉末，易溶于水，在25℃下100 mL水中可溶解18 g，難溶于苯、氯仿和石油醚。熔點(diǎn)為191℃～192℃，旋光度為-180°。莽草酸主要存在于八角茴香、馬尾松、側(cè)柏等天然植物中，尤以八角茴香中含量相對(duì)較多[1]。莽草酸具有鎮(zhèn)痛、抗菌、抗血小板凝集、抗腫瘤、抗血栓形成和抗腦缺血等作用[2-5]。因此，提取莽草酸對(duì)開(kāi)發(fā)和利用我國(guó)豐富的八角茴香資源具有十分重要的意義。

響應(yīng)面分析法（RSM）是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最佳工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法[6]。以水為溶劑利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化八角茴香中的莽草酸提取最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 材料

八角茴香：產(chǎn)于廣西，購(gòu)于本地集貿(mào)市場(chǎng)。莽草酸對(duì)照品（98%）：購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司；高碘酸（AR），高碘酸納（AR），氫氧化鈉（AR），亞硫酸鈉（AR）。

1.1.2 儀器

TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6：國(guó)華電器有限公司；DKB-501A型超級(jí)恒溫水槽：上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AR-1104電子天平：奧克斯國(guó)際貿(mào)易上海有限公司；循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；QE-200高速中藥粉碎機(jī)：武義縣屹立工具有限公司。

1.2 方法

1.2.1 八角茴香莽草酸提取工藝流程

八角茴香→粉碎（過(guò)篩）→八角茴香粉末→提取回流→抽濾→濾液→測(cè)定吸光度

1.2.2 八角茴香莽草酸的提取方法

準(zhǔn)確稱(chēng)取八角茴香粉末約2.0 g，置250 mL圓底燒瓶中，加入一定量的蒸餾水，在實(shí)驗(yàn)條件下回流提取，然后抽濾得濾液，濾液用蒸餾水定容于250 mL容量瓶中，精確量取0.2 mL溶液定容于10 mL容量瓶，測(cè)定其吸光度。

1.2.3 分析測(cè)定方法[7]

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取莽草酸對(duì)照品34.80mg，置于1000mL容量瓶，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度。準(zhǔn)確移取0.2mmol/L的莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL于10 mL容量瓶中，分別加入0.5%的HIO4水溶液和0.5%的Na2IO4水溶液各1.25 mL，搖勻，于37℃放置30 min后冷卻，加入0.056 mol/L的Na2SO3和1 mol/L的NaOH（體積比2∶3）混合液定容至刻度。在室溫下，立即讀取該溶液在382 nm處的吸光度值（A）。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：C=40.9836A-0.0574，R2=0.9995，在 0～55.68μg/mL 的范圍內(nèi)，濃度（C）與吸光度（A）有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve

1.2.3.2 莽草酸提取率的測(cè)定

取一定體積的八角茴香提取液置于10 mL容量瓶中，分別加入0.5%的HIO4水溶液和0.5%的Na2IO4水溶液各1.25 mL，搖勻，于37℃放置30 min后冷卻，加入0.056 mol/L的Na2SO3和1 mol/L的NaOH（體積比2∶3）混合液定容至刻度。在室溫下，立即讀取該溶液在382 nm時(shí)的吸光度值，從回歸方程中計(jì)算提取液中莽草酸的含量。提取率用下式計(jì)算：

2 結(jié)果與討論

2.1 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

分別稱(chēng)取20目的八角茴香粉末約2.0 g，6份。固定提取溫度 80 ℃，料液比 1∶20（g/mL），分別提取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后，提取 1 次，結(jié)果如圖 2 所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)莽草酸提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate

從圖2可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，莽草酸提取率不斷提高，但是當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2.5 h后，提取率基本上增加很少。所以在實(shí)際的提取過(guò)程中要考慮時(shí)間效率和成本因素，提取時(shí)間取2.5 h左右為宜。

2.2 料液比對(duì)提取率的影響

分別稱(chēng)取20目的八角茴香粉末約2.0 g，5份。固定提取溫度80℃，提取時(shí)間1 h，分別在料液比1∶8、1∶14、1∶20、1∶26、1∶32（g/mL）下回流，提取 1 次，結(jié)果如圖3所示。

圖3 料液比對(duì)莽草酸的影響Fig.3 Effect of the ratio of material to solvent on extraction rate

從圖3可以看出，料液比越大，莽草酸的提取率越大。當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g/mL）時(shí)后，提取率增加很少。料液比過(guò)小，溶劑不能有效潤(rùn)濕樣品，影響莽草酸的提取；料液比過(guò)高，增加后續(xù)蒸發(fā)處理的困難，操作成本增加。因此，適宜的料液比取1∶20（g/mL）左右為宜。

2.3 提取溫度對(duì)提取率的影響

分別稱(chēng)取20目的八角茴香粉2.0 g，5份，固定料液比為 1∶20（g/mL），提取時(shí)間為 1 h，提取溫度分別在 50、60、70、80、90℃下提取，提取 1次，結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫度對(duì)莽草酸吸提取率影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate

從圖4可以看出，莽草酸的提取率隨提取溫度的升高而增大。但是當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到70℃后，基本上提取率保持不變。所以在實(shí)際的提取過(guò)程中要考慮時(shí)間效率和操作成本因素，所以在實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)中采用70℃左右為宜。

2.4 原料粒度對(duì)提取率的影響

分別稱(chēng)取過(guò)20目、40目、60目篩的八角茴香粉末約2.0g，各1份，分別在提取溫度80℃，提取時(shí)間為1h，料液比為1∶20（g/mL）下，提取1次，結(jié)果如圖5所示。

圖5 原料粒度對(duì)莽草酸提取率的影響Fig.5 Effect of particle size on extraction rate

從圖5可以看出，原料粉碎得越細(xì),莽草酸的提取率越高，但是，粒數(shù)過(guò)細(xì)，增加處理困難，采用60目左右的八角茴香粉末來(lái)提取莽草酸為宜。

2.5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

稱(chēng)取60目的八角茴香粉末約2.0 g，1份。在固定提取溫度 80 ℃，提取時(shí)間為 1 h，料液比為 1∶20（g/mL）的情況下，分別提取 1、2、3、4、5 次，結(jié)果如表 1 所示。

表1 提取次數(shù)比對(duì)莽草酸的影響Table 1 Effect of extraction times on extraction rate

從表1可以看出，莽草酸的總提取率隨著提取次數(shù)的增加而增大，經(jīng)過(guò)5次提取已基本提取出來(lái)，3次提取即可提出總量的95%，考慮生產(chǎn)成本及效率等方面的因素，所以認(rèn)為提取3次比較合適。

2.6 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)與工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[6，8]，采用響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選取提取時(shí)間、料液比、提取溫度等3個(gè)影響莽草酸提取率的主要因素，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析。在固定原料粒度為60目，提取次數(shù)為1次的情況下，考察3個(gè)因素對(duì)莽草酸提取率的影響，試驗(yàn)因子水平編碼表如表2所示。

表2 響應(yīng)面分析因子及水平表Table 2 Factors and levels of RSM

對(duì)提取時(shí)間、料液比、提取溫度作如下變換。

式中：Z1、Z2、Z3分別表示提取時(shí)間、料液比、提取溫度。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以X1、X2、X3為自變量，以莽草酸提取率（Y）為響應(yīng)值，采用SAS RSREG程序進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Program and experimental results of RSA

其中1～12是析因試驗(yàn)，13～15是中心試驗(yàn),用來(lái)估計(jì)試驗(yàn)誤差。采用SAS 8.0軟件處理上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)所得響應(yīng)面與等直線見(jiàn)圖6～圖8。

采用SAS RSREG程序?qū)憫?yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后,得到回歸方程：

回歸分析結(jié)果見(jiàn)表4，回歸方程中各變量對(duì)指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性，由P檢驗(yàn)來(lái)判定，概率P（Pr>F）的值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。

圖6 提取時(shí)間（X1）和料液比（X2）對(duì)提取率影響的響應(yīng)面與等值線Fig.6 Responsive surfaces and contours of Z=f(Xl，X2)

圖7 提取時(shí)間（X1）和提取溫度（X3）對(duì)提取率影響的響應(yīng)面與等值線Fig.7 Responsive surfaces and contours of Z=f(Xl，X3)

圖8 料液比（X2）和提取溫度（X3）對(duì)提取率影響的響應(yīng)面與等值線Fig.8 Responsive surfaces and contours of Z=f(X2，X3)

由表4可見(jiàn)，各因素中一次項(xiàng)X1，X2，X3和二次項(xiàng)X2X2都是高度顯著的，二次項(xiàng)X1X1，X3X3和X1X3顯著，因此各具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)面的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系?；貧w方程也是高度顯著的，相關(guān)系數(shù)R2=97.80%，說(shuō)明響應(yīng)值（提取率）的變化有97.80%來(lái)源于提取時(shí)間、料液比和提取溫度3個(gè)變量。因此，回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳工藝條件。對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，整理可得：

解聯(lián)立方程組得：X1=0.9195，X2=0.2783，X3=0.2393。代入前述的變換公式得到最佳提取時(shí)間為2.92 h，料液比為 1∶21.67（g/mL），提取溫度為 82.39 ℃，為了操作的方便，將其修正為提取時(shí)間3.0 h，料液比1∶22（g/mL），提取時(shí)間為 83℃，即八角茴香莽草酸提取工藝最佳工藝條件為：提取時(shí)間為3.0 h、料液比為1∶22（g/mL）、溫度為 83 ℃。該模型的 R2=0.9780，此模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合較好，試驗(yàn)失擬項(xiàng)小，因此可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。用此數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)最佳條件下的提取率為8.873%。實(shí)驗(yàn)提取率與理論預(yù)測(cè)值結(jié)果見(jiàn)表3。

表4 莽草酸回歸分析結(jié)果Table 4 Results of regression analysis

2.7 最優(yōu)條件下驗(yàn)證

準(zhǔn)稱(chēng)3份八角茴香粉末，每份約2.0 g，分別在最佳提取條件：提取時(shí)間 3.0 h、料液比為 1∶22（g/mL）、溫度為83℃下提取1次，結(jié)果如表5所示。

表5 最佳條件的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 The experimental results in the optimum extraction conditions

由表5可見(jiàn)，莽草酸在最佳條件下一次提取率為8.779%，由數(shù)學(xué)模型得到理論預(yù)測(cè)值為8.873%，實(shí)際提取率比理論預(yù)測(cè)值僅低了0.094%。因此，建立的二次回歸模型能很好地預(yù)測(cè)莽草酸的提取率。

3 結(jié)論

通過(guò)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法，能可靠地進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)以及數(shù)據(jù)分析。應(yīng)用這一方法對(duì)莽草酸提取的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，取得了較好的效果。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)中心組合試驗(yàn)，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析法試驗(yàn)。最終得到二次回歸方程，確定出八角茴香莽草酸的最佳提取條件為：提取時(shí)間為 3.0 h，料液比是 1∶22（g/mL），提取溫度是 83 ℃；單因素實(shí)驗(yàn)確定其最佳提取次數(shù)為3次。在最佳提取工藝條件下的一次提取率為8.779%，一次提取理論預(yù)測(cè)值為8.873%。實(shí)際提取率比理論預(yù)測(cè)值僅低了0.094%，因此該二次回歸數(shù)學(xué)模型能準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)八角茴香中莽草酸的提取率。

[1]陳驍熠,袁利,王敏,等.馬尾松、側(cè)柏和八角茴香中的莽草酸含量分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,48(5):1238-1240

[2]Fang A Q,Demain A L,Wong G K.Enhancement of the antifungal activity of rapamycin by the coproduced elaiophylin and nigericin[J].The journal of antibiotics,2000,53(2):158

[3]林潔,蘭琪欣,韋應(yīng)芳,等.八角茴香藥用成分的提取及其鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].右江民族醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,30(2):195-196

[4]Huang F,Xiu Q.Anti-platelet and anti-thrombotic effects of triacetyl shikimic acid in rats[J].Journal of cardiovascular pharmacology,2002,39(2):262-270

[5]Ma Yi,Xu Qiu-Ping,Sun Jian-Ning.Antagonistic effects of shikimic acid against focal cerebral ischemia injury in rats subjected to middle cerebral artery thrombosis[J].Acta Pharmacologica Sinica,1999,20(8):696-700

[6]高洪霞,劉軍海,于波濤.響應(yīng)面分析法優(yōu)化辣椒紅色素提取工藝條件[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2009,30(10):177-181

[7]TH克羅馬蒂,ND波爾格.莽草酸的檢測(cè)方法:中國(guó),00806428.8[P].2002-05-29

[8]徐效圣,潘儼,傅力,等.響應(yīng)面法優(yōu)化水酶法提取核桃油的工藝條件[J].食品與機(jī)械,2010(2):92-96