林維宣，陳溪，張寧，董偉峰，王秋艷，趙景紅

（1.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連116001；2.大連出入境檢驗檢疫局，遼寧 大連 116001）

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是獸醫(yī)臨床上十分重要的一類抗生素，廣泛用于畜禽細菌性和支原體感染的化學治療，同時也是重要的生長促進劑，在動物藥品和飼料添加物中占有重要位置。它包括螺旋霉素（spiramycin）、替米考星（tilmicosin）、竹桃霉素（oleandomycin）、泰樂菌素（tylosin）、紅霉素（erythromycin）、羅紅霉素（roxithromycin）、交沙霉素（josamycin）等多種獸藥[1]。

食品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留可引起過敏和攜帶耐藥基因的擴散，對人們威脅很大，許多國家對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在動物上的使用和在食品中的殘留進行了嚴格的監(jiān)控。美國、歐盟、日本等國家都已規(guī)定了大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在動物源性食品中的殘留限量。

大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的檢測方法主要有：微生物法、免疫分析法（ELISA）、薄層色譜法（TLC）、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC/MS）、高效液相色譜法（HPLC）、液質(zhì)聯(lián)用法（LC/MS，LC-MS/MS）等。微生物效價法選擇性低，特異性不高，且僅檢測單一藥物的殘留。免疫分析法（ELISA），特別是近來發(fā)展的放射受體分析法（CharmⅡ法），涉及的樣品前處理簡單、快速，具有良好的特異性和靈敏度，但因影響因素多且難以控制，難以實現(xiàn)多殘留分析。薄層色譜法主要應用于原料藥和制劑中大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的分析。該方法設備簡單，檢驗成本低，操作簡便快速，但缺點是分離能力較差，檢測靈敏度較低，不適合食品中MALs殘留的微量分析。由于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素分子量比較大（一般都在500以上），且分子結(jié)構(gòu)中大多帶有多個極性基團，不能直接采用氣相色譜方法檢測，必須衍生后才可以用氣質(zhì)聯(lián)用法檢測。由于衍生過程繁瑣，對于動物產(chǎn)品樣品處理過程十分復雜，限制了該方法的應用。高效液相譜法檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗生素盡管有些文獻報導[2-4]，檢測器通常為紫外檢測器。近年來液質(zhì)聯(lián)用法檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的研究比較活躍,用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶、蜂王漿、蜂蜜、鰻魚、目魚、河水中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的方法已有報導[5-10]。

本課題利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)，研究建立腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量的檢測和確證方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與裝置

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB公司API4000，配有電噴霧離子源；固相萃取裝置：Waters公司，12孔；HB－4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：IKA公司；LD5－2A離心機：轉(zhuǎn)速4000 r/min 以上；均質(zhì)器：美國 WARING，10000 r/min；氮吹儀：美國Organomation氮吹儀N－EVAPIII型，24孔。

1.2 主要材料與試劑

10 mmol/L乙酸胺溶液（pH 4.5），0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=8.5），0.25 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0）。C18固相萃取小柱（500 mg/6 mL），Oasis（HLB）固相萃取小柱（500 mg/6 mL），MCX固相萃取小柱（500 mg/6 mL）。螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素磷酸鹽、泰樂菌素酒石酸鹽、紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素標準品：純度大于等于95%。

7種大環(huán)內(nèi)酯標準儲備溶液：分別稱取經(jīng)折算適量標準品，分別用甲醇溶解為濃度為100μg/mL，1℃～4℃冰箱保存，臨用前根據(jù)需要用甲醇稀釋適當濃度的工作液。

1.3 提取和凈化

1.3.1 提取

稱取5 g均勻試樣（精確到0.01 g）置于50 mL具塞離心管中，加25 mL甲醇，渦旋，于4000 r/min離心3 min，將上層甲醇提取液收集于50 mL容量瓶中，再加20 mL甲醇，重復上述操作，合并甲醇提取液，加甲醇定容至50 mL。精密量取10 mL甲醇提取液于20 mL離心管中，在45℃以下水浴減壓濃縮至近干，用15 mL磷酸鹽緩沖溶液分次溶解殘渣。

1.3.2 凈化

Oasis（HLB）小柱（500 mg，6 mL，或相當者）依次用5 mL甲醇、5 mL水預洗。將提取液轉(zhuǎn)移過HLB凈化柱，棄去流出液，用 5 mL 水和 5 mL 甲醇－水（3∶7，體積比）依次洗滌離心管，洗滌液過HLB柱，棄去流出液，負壓抽干，用6 mL甲醇洗脫。收集全部洗脫液，在45℃以下水浴減壓濃縮至近干，加2 mL甲醇－水（1∶1，體積比）溶解，混勻，過0.22μm針筒濾膜，進LC-MS/MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

液相色譜柱：ZORBAXEclipseC8柱，5μm，150mm×4.6 mm（i.d）；流動相：B 組分是乙腈，A 組分是 0.15%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0→3.5min，A=70%→30%；3.5→8 min，A=30%；8→10 min，A=30%→70%；10→16 min，A=70%。流速：400μL/min；進樣量：20μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源。掃描方式：正離子掃描。檢測方式：多反應選擇離子檢測（MRM）。分辯率：Q1和Q3均為單位分辨率。電噴霧電壓：5500V。電噴霧電壓（IS）：4800 V；霧化氣壓力（GS1）：42 Psi（即289.6×103Pa）；氣簾氣壓力（CUR）：25 Psi（即172.4×103Pa）；輔助氣流速（GS2）：45 Psi（即310.3×103Pa）；離子源溫度（TEM）：540℃；碰撞氣（CAD）：6 Psi（即41.4×103Pa）。其它參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

分別選用 ZORBAX Eclipse XDB-C85μm，4.6 mm×150 mm（i.d）、ZORBAX Eclipse XDB－C185μm，4.6 mm×150 mm（i.d），Lichrospher C18柱，5μm，4.6 mm×250 mm（i.d），結(jié)果表明各種色譜柱均適用，實驗選定ZORBAX Eclipse XDB－C8（4.6 mm×150 mm、5μm）色譜柱。

2.2 流動相的選擇

研究了甲醇－0.15%甲酸和乙腈－0.15%甲酸溶液兩種流動相的色譜分離效果，結(jié)果表明乙腈－0.15%甲酸溶液作為流動相效果最好。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化選擇

分別采用7種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥標準溶液在正離子模式下進行母離子全掃描，再對其子離子進行全掃描，對其質(zhì)譜條件進行了一系列的優(yōu)化，確定定性定量離子對，兼顧各成分靈敏度的不同而對離子源條件有所偏重，建立了最佳質(zhì)譜條件。

2.4 樣品提取溶劑的選擇

大環(huán)內(nèi)酯類獸藥屬于極性物質(zhì)，易溶于甲醇、乙腈。試驗結(jié)果表明，用乙腈、甲醇提取樣品，大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的回收率大于70%，兩者沒有顯著差異，考慮到成本和毒性，本文選用甲醇提取方法。

2.5 凈化條件的選擇

試驗了 C18、Oasis（HLB）和 MCX 固相萃取柱對樣品中大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留的凈化效果。C18和Oasis（HLB）兩種凈化柱效果較好，回收率在70%～110%之間。對MCX小柱，交沙霉素不能洗脫下來。綜合考慮，實驗選定Oasis（HLB）柱，淋洗條件為：5 mL水和5 mL甲醇－水（3+7，V/V）依次洗滌小柱，然后用6 mL甲醇洗脫。

2.6 線性范圍

用7種大環(huán)內(nèi)酯混合標準工作曲線溶液繪制成標準曲線用工作液，按上述色譜和質(zhì)譜條件測定其峰面積，以質(zhì)量濃度X（μg/kg）為橫坐標，峰面積的比值Y為縱坐標，繪制7種大環(huán)內(nèi)酯混合標準溶液工作曲線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表2。

表2 線性方程Table 2 The linear equation

結(jié)果表明，7種大環(huán)內(nèi)酯類藥物濃度與對應的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性范圍：10μg/kg～250μg/kg。

2.7 檢測低限

按所建立的色譜條件，以3倍噪音比作為檢測低限，測得本方法7種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的測定低限均為20μg/kg，滿足國內(nèi)和國際對大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留監(jiān)控的要求。

2.8 回收率與精密度

以不含大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的腸衣為空白樣品，分別添加7種大環(huán)內(nèi)酯混合標準溶液,添加濃度為20、100、200μg/kg 3個濃度水平，按照上述方法進行6次重復實驗，測得回收率和精密度，回收率為70.9%～98.4%；相對標準偏差5.8%～17.8%。

腸衣空白樣品和添加濃度為20μg/kg的樣品的LC-MS/MS選擇離子流圖譜圖見圖1～圖2。

保留時間（min）：螺旋霉素（spiramycin）9.26 ，替米考星（tilmicosin）9.63，竹桃霉素（leandomycin）10.01，泰樂菌素（tylosin）10.17，紅霉素（erythromycin）10.11，羅紅霉素（roxithromycin）10.59，交沙霉素（josamycin）11.04。

2.9 樣品檢測

采用上述方法對出口保留的和市場上購買的10個豬腸衣樣品檢驗，結(jié)果均為未檢出。

圖1 空白腸衣樣品的選擇離子流圖Fig.1 Selected ion chromatograms of macrolides in blank Pig Casing

3 結(jié)論

建立了腸衣中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰樂菌素、紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素等7種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。試樣用甲醇提取，Oasis（HLB）固相萃取柱凈化，以ZORBAX Eclipse C8（150 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱，乙腈-0.15%甲酸水溶液為流動相，梯度洗脫，電噴霧、正離子掃描模式分離與檢測7種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量。通過對質(zhì)譜條件的一系列優(yōu)化，兼顧各成分的靈敏度，建立了最佳質(zhì)譜分析條件。7種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢出限均為20μg/kg，平均回收率為70.9%～98.4%，相對標準偏差5.8%～17.8%。方法的技術(shù)指標滿足國內(nèi)外對腸衣中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留檢測的有關(guān)要求。

圖2 添加20μg/kg 7種大環(huán)內(nèi)酯腸衣樣品的選擇離子流圖Fig.2 Selected ion chromatograms of macrolides in spiked Pig Casing(20μg/kg)

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