林維宣,陳溪,張寧,董偉峰,王秋艷,趙景紅
(1.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧大連116001;2.大連出入境檢驗(yàn)檢疫局,遼寧 大連 116001)
大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素是獸醫(yī)臨床上十分重要的一類(lèi)抗生素,廣泛用于畜禽細(xì)菌性和支原體感染的化學(xué)治療,同時(shí)也是重要的生長(zhǎng)促進(jìn)劑,在動(dòng)物藥品和飼料添加物中占有重要位置。它包括螺旋霉素(spiramycin)、替米考星(tilmicosin)、竹桃霉素(oleandomycin)、泰樂(lè)菌素(tylosin)、紅霉素(erythromycin)、羅紅霉素(roxithromycin)、交沙霉素(josamycin)等多種獸藥[1]。
食品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留可引起過(guò)敏和攜帶耐藥基因的擴(kuò)散,對(duì)人們威脅很大,許多國(guó)家對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素在動(dòng)物上的使用和在食品中的殘留進(jìn)行了嚴(yán)格的監(jiān)控。美國(guó)、歐盟、日本等國(guó)家都已規(guī)定了大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素在動(dòng)物源性食品中的殘留限量。
大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)獸藥的檢測(cè)方法主要有:微生物法、免疫分析法(ELISA)、薄層色譜法(TLC)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC/MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS,LC-MS/MS)等。微生物效價(jià)法選擇性低,特異性不高,且僅檢測(cè)單一藥物的殘留。免疫分析法(ELISA),特別是近來(lái)發(fā)展的放射受體分析法(CharmⅡ法),涉及的樣品前處理簡(jiǎn)單、快速,具有良好的特異性和靈敏度,但因影響因素多且難以控制,難以實(shí)現(xiàn)多殘留分析。薄層色譜法主要應(yīng)用于原料藥和制劑中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)獸藥的分析。該方法設(shè)備簡(jiǎn)單,檢驗(yàn)成本低,操作簡(jiǎn)便快速,但缺點(diǎn)是分離能力較差,檢測(cè)靈敏度較低,不適合食品中MALs殘留的微量分析。由于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素分子量比較大(一般都在500以上),且分子結(jié)構(gòu)中大多帶有多個(gè)極性基團(tuán),不能直接采用氣相色譜方法檢測(cè),必須衍生后才可以用氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)。由于衍生過(guò)程繁瑣,對(duì)于動(dòng)物產(chǎn)品樣品處理過(guò)程十分復(fù)雜,限制了該方法的應(yīng)用。高效液相譜法檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素盡管有些文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[2-4],檢測(cè)器通常為紫外檢測(cè)器。近年來(lái)液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的研究比較活躍,用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)牛奶、蜂王漿、蜂蜜、鰻魚(yú)、目魚(yú)、河水中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的方法已有報(bào)導(dǎo)[5-10]。
本課題利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù),研究建立腸衣中多種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素殘留量的檢測(cè)和確證方法。
液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀:美國(guó)AB公司API4000,配有電噴霧離子源;固相萃取裝置:Waters公司,12孔;HB-4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:IKA公司;LD5-2A離心機(jī):轉(zhuǎn)速4000 r/min 以上;均質(zhì)器:美國(guó) WARING,10000 r/min;氮吹儀:美國(guó)Organomation氮吹儀N-EVAPIII型,24孔。
10 mmol/L乙酸胺溶液(pH 4.5),0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=8.5),0.25 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)。C18固相萃取小柱(500 mg/6 mL),Oasis(HLB)固相萃取小柱(500 mg/6 mL),MCX固相萃取小柱(500 mg/6 mL)。螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素磷酸鹽、泰樂(lè)菌素酒石酸鹽、紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素標(biāo)準(zhǔn)品:純度大于等于95%。
7種大環(huán)內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取經(jīng)折算適量標(biāo)準(zhǔn)品,分別用甲醇溶解為濃度為100μg/mL,1℃~4℃冰箱保存,臨用前根據(jù)需要用甲醇稀釋適當(dāng)濃度的工作液。
1.3.1 提取
稱取5 g均勻試樣(精確到0.01 g)置于50 mL具塞離心管中,加25 mL甲醇,渦旋,于4000 r/min離心3 min,將上層甲醇提取液收集于50 mL容量瓶中,再加20 mL甲醇,重復(fù)上述操作,合并甲醇提取液,加甲醇定容至50 mL。精密量取10 mL甲醇提取液于20 mL離心管中,在45℃以下水浴減壓濃縮至近干,用15 mL磷酸鹽緩沖溶液分次溶解殘?jiān)?/p>
1.3.2 凈化
Oasis(HLB)小柱(500 mg,6 mL,或相當(dāng)者)依次用5 mL甲醇、5 mL水預(yù)洗。將提取液轉(zhuǎn)移過(guò)HLB凈化柱,棄去流出液,用 5 mL 水和 5 mL 甲醇-水(3∶7,體積比)依次洗滌離心管,洗滌液過(guò)HLB柱,棄去流出液,負(fù)壓抽干,用6 mL甲醇洗脫。收集全部洗脫液,在45℃以下水浴減壓濃縮至近干,加2 mL甲醇-水(1∶1,體積比)溶解,混勻,過(guò)0.22μm針筒濾膜,進(jìn)LC-MS/MS分析。
1.4.1 液相色譜條件
液相色譜柱:ZORBAXEclipseC8柱,5μm,150mm×4.6 mm(i.d);流動(dòng)相:B 組分是乙腈,A 組分是 0.15%甲酸水溶液;梯度洗脫程序:0→3.5min,A=70%→30%;3.5→8 min,A=30%;8→10 min,A=30%→70%;10→16 min,A=70%。流速:400μL/min;進(jìn)樣量:20μL。
1.4.2 質(zhì)譜條件
離子源:電噴霧離子源。掃描方式:正離子掃描。檢測(cè)方式:多反應(yīng)選擇離子檢測(cè)(MRM)。分辯率:Q1和Q3均為單位分辨率。電噴霧電壓:5500V。電噴霧電壓(IS):4800 V;霧化氣壓力(GS1):42 Psi(即289.6×103Pa);氣簾氣壓力(CUR):25 Psi(即172.4×103Pa);輔助氣流速(GS2):45 Psi(即310.3×103Pa);離子源溫度(TEM):540℃;碰撞氣(CAD):6 Psi(即41.4×103Pa)。其它參數(shù)見(jiàn)表1。
表1 質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters
分別選用 ZORBAX Eclipse XDB-C85μm,4.6 mm×150 mm(i.d)、ZORBAX Eclipse XDB-C185μm,4.6 mm×150 mm(i.d),Lichrospher C18柱,5μm,4.6 mm×250 mm(i.d),結(jié)果表明各種色譜柱均適用,實(shí)驗(yàn)選定ZORBAX Eclipse XDB-C8(4.6 mm×150 mm、5μm)色譜柱。
研究了甲醇-0.15%甲酸和乙腈-0.15%甲酸溶液兩種流動(dòng)相的色譜分離效果,結(jié)果表明乙腈-0.15%甲酸溶液作為流動(dòng)相效果最好。
分別采用7種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)獸藥標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,再對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描,對(duì)其質(zhì)譜條件進(jìn)行了一系列的優(yōu)化,確定定性定量離子對(duì),兼顧各成分靈敏度的不同而對(duì)離子源條件有所偏重,建立了最佳質(zhì)譜條件。
大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)獸藥屬于極性物質(zhì),易溶于甲醇、乙腈。試驗(yàn)結(jié)果表明,用乙腈、甲醇提取樣品,大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)獸藥的回收率大于70%,兩者沒(méi)有顯著差異,考慮到成本和毒性,本文選用甲醇提取方法。
試驗(yàn)了 C18、Oasis(HLB)和 MCX 固相萃取柱對(duì)樣品中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)獸藥殘留的凈化效果。C18和Oasis(HLB)兩種凈化柱效果較好,回收率在70%~110%之間。對(duì)MCX小柱,交沙霉素不能洗脫下來(lái)。綜合考慮,實(shí)驗(yàn)選定Oasis(HLB)柱,淋洗條件為:5 mL水和5 mL甲醇-水(3+7,V/V)依次洗滌小柱,然后用6 mL甲醇洗脫。
用7種大環(huán)內(nèi)酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線用工作液,按上述色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定其峰面積,以質(zhì)量濃度X(μg/kg)為橫坐標(biāo),峰面積的比值Y為縱坐標(biāo),繪制7種大環(huán)內(nèi)酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線,計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù),見(jiàn)表2。
表2 線性方程Table 2 The linear equation
結(jié)果表明,7種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性范圍:10μg/kg~250μg/kg。
按所建立的色譜條件,以3倍噪音比作為檢測(cè)低限,測(cè)得本方法7種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的測(cè)定低限均為20μg/kg,滿足國(guó)內(nèi)和國(guó)際對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留監(jiān)控的要求。
以不含大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物殘留的腸衣為空白樣品,分別添加7種大環(huán)內(nèi)酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,添加濃度為20、100、200μg/kg 3個(gè)濃度水平,按照上述方法進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn),測(cè)得回收率和精密度,回收率為70.9%~98.4%;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差5.8%~17.8%。
腸衣空白樣品和添加濃度為20μg/kg的樣品的LC-MS/MS選擇離子流圖譜圖見(jiàn)圖1~圖2。
保留時(shí)間(min):螺旋霉素(spiramycin)9.26 ,替米考星(tilmicosin)9.63,竹桃霉素(leandomycin)10.01,泰樂(lè)菌素(tylosin)10.17,紅霉素(erythromycin)10.11,羅紅霉素(roxithromycin)10.59,交沙霉素(josamycin)11.04。
采用上述方法對(duì)出口保留的和市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的10個(gè)豬腸衣樣品檢驗(yàn),結(jié)果均為未檢出。
圖1 空白腸衣樣品的選擇離子流圖Fig.1 Selected ion chromatograms of macrolides in blank Pig Casing
建立了腸衣中螺旋霉素、替米考星、竹桃霉素、泰樂(lè)菌素、紅霉素、羅紅霉素、交沙霉素等7種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素殘留量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。試樣用甲醇提取,Oasis(HLB)固相萃取柱凈化,以ZORBAX Eclipse C8(150 mm×4.6 mm,5μm)色譜柱,乙腈-0.15%甲酸水溶液為流動(dòng)相,梯度洗脫,電噴霧、正離子掃描模式分離與檢測(cè)7種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素殘留量。通過(guò)對(duì)質(zhì)譜條件的一系列優(yōu)化,兼顧各成分的靈敏度,建立了最佳質(zhì)譜分析條件。7種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素的檢出限均為20μg/kg,平均回收率為70.9%~98.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差5.8%~17.8%。方法的技術(shù)指標(biāo)滿足國(guó)內(nèi)外對(duì)腸衣中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素殘留檢測(cè)的有關(guān)要求。
圖2 添加20μg/kg 7種大環(huán)內(nèi)酯腸衣樣品的選擇離子流圖Fig.2 Selected ion chromatograms of macrolides in spiked Pig Casing(20μg/kg)
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