王 巍 席 梅 黃文政 朱小棣

（1.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250031；2.山東省濟(jì)南市第四人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250031；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，天津 300193）

系膜增殖性腎炎（MsPGN）是原發(fā)性腎小球疾病中最常見(jiàn)的病理類型，約占我國(guó)原發(fā)性腎小球疾病腎穿刺患者的50%左右，而在終末期腎病腎小球硬化的原發(fā)病當(dāng)中也占有極大的比例。本研究采用腎疏寧治療大鼠原發(fā)性MsPGN，從病理角度探討防治MsPGN向腎小球硬化進(jìn)展的病理形態(tài)改變。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 遠(yuǎn)交系健康Wistar大白鼠56只，體質(zhì)量（160±10）g，10周齡，雌雄各半，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院第四研究所提供。動(dòng)物經(jīng)普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，尿蛋白定性檢查、尿沉渣鏡檢均呈陰性。

1.2 藥物與試劑 葡萄球菌腸毒素B（SEB）由解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供，批號(hào)：2003.05。完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑為GIBCO公司產(chǎn)品。牛血清白蛋白（BSA）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所提供。腎疏寧由生黃芪、柴胡、黃芩、丹參等組成，藥材購(gòu)自天津中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中藥房，按比例稱取后加水濃煎提取生藥質(zhì)量濃度為2.50 g/mL，由天津中一制藥廠煎制。苯那普利由北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：10 mg/片。

1.3 分組與造模 在雌雄均分的基礎(chǔ)上，采用隨機(jī)方法將實(shí)驗(yàn)大鼠分為正常組、模型組、腎疏寧組、苯那普利組，每組14只。參照文獻(xiàn)［1］報(bào)道造模方法加以改進(jìn)。自實(shí)驗(yàn)第1日起，模型組、腎疏寧組、苯那普利組以牛血清白蛋白20 mg配成水溶液隔日灌胃1次，正常組給等量生理鹽水隔日灌胃1次，共12～16周。實(shí)驗(yàn)第1日模型組、腎疏寧組、苯那普利組經(jīng)皮下分點(diǎn)注射完全弗氏佐劑0.2 mL（含BSA 2 mg）、第8日注射不完全弗氏佐劑0.2 mL（含BSA 2 mg），實(shí)驗(yàn)第8、15日鼠尾靜脈注射葡萄球菌腸毒素B（SEB）0.4 mg/kg體質(zhì)量（配成水溶液）各1次。正常組給予等量生理鹽水注射。

1.4 給藥方法 治療組自造模第1日開(kāi)始給藥，給藥劑量按馬氏定理計(jì)算，均給予成人劑量（60 kg體質(zhì)量）的15倍灌胃。中藥組予腎疏寧灌胃，苯那普利組予苯那普利配成生理鹽水溶液，以4 mg/（kg·d）灌胃，正常組、模型組給等量生理鹽水灌胃。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 第12周末（每組6只）、16周末（每組8只）分別處死大鼠取同側(cè)腎臟。腎臟組織標(biāo)本用10%甲醛固定，石蠟包埋切成 3μm切片，進(jìn)行 HE、PAS、Masson染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變。采用HPIAS-2000高清晰度彩色圖文病理分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行病理圖像分析。每份樣本均在400倍顯微鏡下，視野上、下、左、右、中各取2個(gè)腎小球（共10個(gè)），數(shù)碼攝像頭采集腎小球圖像。在PAS染色中采集系膜基質(zhì)著色區(qū)，畫(huà)定腎小球毛細(xì)血管襻區(qū)域，HPIAS進(jìn)行腎小球分析，得出10個(gè)腎小球系膜基質(zhì)面積/腎小球毛細(xì)血管襻面積比（腎小球系膜基質(zhì)相對(duì)面積）的平均值，為基質(zhì)增多的相對(duì)含量；并測(cè)量相應(yīng)腎小球中5個(gè)開(kāi)放最好的毛細(xì)血管直徑以觀察毛細(xì)血管開(kāi)放程度。每份標(biāo)本至少計(jì)數(shù)30個(gè)腎小球，觀察毛細(xì)血管開(kāi)放直徑、基質(zhì)增殖面積比，取平均值作為該標(biāo)本的數(shù)值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以（）表示。經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布后，同批次分組間采用多組間單因素方差分析作統(tǒng)計(jì)分析，同組間前后比較采用獨(dú)立樣本間T檢驗(yàn)，檢驗(yàn)顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 病理學(xué)改變 12周末：正常組大鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)無(wú)增生，毛細(xì)血管襻開(kāi)放，腎小管結(jié)構(gòu)規(guī)則，間質(zhì)無(wú)增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組大鼠部分腎小球萎縮、纖維化，個(gè)別腎小球呈分葉狀，PAS染色可見(jiàn)彌漫性腎小球系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕中度增生，毛細(xì)血管腔狹窄，腎小囊輕度擴(kuò)張，腎小管間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)輕度纖維化；腎疏寧組腎小球系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕度增生，毛細(xì)血管腔輕度狹窄，腎小管輕度變性，間質(zhì)有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；苯那普利組腎小球系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕度增生，毛細(xì)血管腔輕度狹窄，腎小囊輕度擴(kuò)張，腎小管變性，間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，有局灶性纖維化。16周末：正常組表現(xiàn)同12周；模型組大鼠彌漫性腎小球萎縮、纖維化，毛細(xì)血管襻部分呈分葉狀改變，系膜基質(zhì)中度增生，個(gè)別腎小囊擴(kuò)張，毛細(xì)血管襻與腎小囊粘連，毛細(xì)血管腔廣泛性受壓，部分狹窄閉塞，腎小管上皮細(xì)胞變性、脫落，間質(zhì)有大量膠原纖維增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)；腎疏寧組系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕度增生，毛細(xì)血管開(kāi)放，腎小囊正常，上皮細(xì)胞輕度變性，間質(zhì)膠原纖維輕度增生，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；苯那普利組系膜細(xì)胞、基質(zhì)增生，毛細(xì)血管腔狹窄，間質(zhì)局部有纖維組織增生及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.2 各組大鼠毛細(xì)血管開(kāi)放程度比較 12周時(shí)造模各組毛細(xì)血管均有不同程度的狹窄，與正常組相比，存在顯著差異（P<0.05或0.01），腎疏寧組與苯那普利組比較無(wú)明顯差別。16周時(shí)模型組毛細(xì)血管腔進(jìn)一步狹窄（P<0.01），腎疏寧組毛細(xì)血管腔擴(kuò)張明顯優(yōu)于苯那普利組（P<0.05），說(shuō)明腎疏寧遠(yuǎn)期效果較好。

表1 各組大鼠毛細(xì)血管開(kāi)放程度比較（μm，）

表1 各組大鼠毛細(xì)血管開(kāi)放程度比較（μm，）

與正常組同時(shí)期比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組同時(shí)期比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與苯那普利組同時(shí)期比較，▲P＜0.05。下同。

時(shí) 期 n 正常組 模型組 腎疏寧組 苯那普利組12 周 6 8.83±1.12 5.91±0.92** 6.94±0.76*△△ 6.46±0.71*△16 周 8 9.65±1.25 5.68±1.24** 8.38±1.45*△△▲ 6.79±1.53**△

2.3 各組大鼠腎小球系膜基質(zhì)相對(duì)面積比較 12周時(shí)模型組腎小球系膜基質(zhì)相對(duì)面積增加明顯（P<0.01），兩治療組雖有所增加，與正常組比較無(wú)明顯差別（P>0.05），但與模型組相比差異顯著（P<0.01），說(shuō)明治療效果明顯。16周時(shí)模型組系膜基質(zhì)相對(duì)面積進(jìn)一步增大（P<0.01），腎疏寧組、苯那普利組均有所增加，但苯那普利組增加顯著（P<0.01），與腎疏寧組有明顯差異（P<0.05），說(shuō)明腎疏寧長(zhǎng)期治療效果較佳。

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠腎小球系膜基質(zhì)相對(duì)面積（%，）

表2 實(shí)驗(yàn)大鼠腎小球系膜基質(zhì)相對(duì)面積（%，）

時(shí) 期 n 正常組 模型組 腎疏寧組 苯那普利組12 周 6 7.91±2.48 20.12±5.52** 8.65±4.04△△ 9.63±3.96△△16 周 8 8.13±1.96 29.72±9.47** 9.91±2.48△▲ 13.79±4.76**△

3 討 論

在我們的前期工作中［2］，參照文獻(xiàn)［1］的 MsPGN 大鼠模型制作的基礎(chǔ)上，綜合應(yīng)用SEB尾靜脈注射，BSA灌胃及弗氏佐劑皮下注射，并將造模時(shí)間延長(zhǎng)至10周，復(fù)制成功了大鼠系膜增生性腎炎模型，結(jié)果顯示：模型組大鼠第10周變化，光鏡可見(jiàn)彌漫的輕重不等的系膜組織增生，個(gè)別小球血管消失，結(jié)構(gòu)破壞。

腎疏寧系針對(duì)MsPGN的臟腑功能受損、濕熱瘀血之病理，以樞利少陽(yáng)、益氣養(yǎng)陰、清熱利濕解毒、活血化瘀為治法。藥物應(yīng)用柴胡、黃芩樞利少陽(yáng)，通利三焦；以益母草、丹參、鬼箭羽、白花蛇舌草等清熱活血泄?jié)?；生黃芪補(bǔ)益脾肺，山茱萸肉滋補(bǔ)肝腎。本研究在以往實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將造模時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)到12、16周，觀察腎小球病理變化演變狀況，同步觀察12、16周末腎疏寧、苯那普利的治療結(jié)果。病理顯示：12周模型組大鼠部分腎小球萎縮、纖維化，個(gè)別腎小球呈分葉狀，PAS染色可見(jiàn)彌漫性腎小球系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)輕中度增生，毛細(xì)血管腔狹窄，腎小囊輕度擴(kuò)張。腎小管間質(zhì)時(shí)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并出現(xiàn)輕度纖維化。進(jìn)一步延長(zhǎng)至16周末：模型組大鼠彌漫性腎小球萎縮、纖維化，毛細(xì)血管襻部分呈分葉狀改變，系膜基質(zhì)中度增生，個(gè)別腎小囊擴(kuò)張，毛細(xì)血管襻與腎小囊粘連，毛細(xì)血管腔廣泛性受壓，部分狹窄閉塞，腎小管上皮細(xì)胞變性、脫落，間質(zhì)有大量膠原纖維增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

對(duì)各實(shí)驗(yàn)組大鼠的腎臟光鏡、電鏡組織學(xué)變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)連續(xù)的觀察比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：12、16周模型組大鼠腎組織損傷程度隨疾病進(jìn)展逐漸加重，足細(xì)胞足突有明顯的融合現(xiàn)象，系膜細(xì)胞、系膜基質(zhì)明顯增多，隨時(shí)間推移逐漸加重，球囊粘連的出現(xiàn)也表明硬化過(guò)程中腎小囊上皮細(xì)胞也參與了硬化過(guò)程。造模的過(guò)程表現(xiàn)出了病理?yè)p害模型穩(wěn)定，病理變化突出、病變進(jìn)展明顯的特點(diǎn)，出現(xiàn)經(jīng)典腎小球硬化的表現(xiàn)需要時(shí)間較長(zhǎng)。

腎疏寧、苯那普利組12、16周未發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞足突融合、基底膜增厚等改變，腎疏寧治療組與苯那普利組均不同程度減輕了大鼠腎小球的病理變化，隨著疾病進(jìn)程兩治療組均未呈現(xiàn)疾病明顯的進(jìn)展過(guò)程，證明腎疏寧能夠控制MsPGN的發(fā)展趨勢(shì)，防止腎小球硬化的產(chǎn)生，其病理形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)來(lái)自于保護(hù)腎小球的正常結(jié)構(gòu)，防止細(xì)胞外基質(zhì)的積聚上。

［1］劉震，周樹(shù)錄，譚建三，等.大鼠系膜增生性腎炎模型的改進(jìn)［J］.華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，27（2）：182-184.

［2］黃懷鵬，陳志強(qiáng)，陳玉林，等.大鼠系膜增生性腎炎的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2003，21（2）：271-272.