溫善姍 萬海同 張宇燕 楊潔紅

（浙江中醫(yī)藥大學，浙江 杭州 310053）

烏頭堿為烏頭屬植物的一種常見的含有二酯二萜的生物堿，其既是烏頭（附子）的主要有效成分，又是主要毒性成分。烏頭堿的有效劑量和中毒劑量相差甚微，其致死量為3～4 mg，人口服0.2 mg即導致中毒，主要表現(xiàn)為心血管系統(tǒng)毒性［1］。烏頭堿毒性的研究較多，而通過原代心肌細胞研究其強心作用的研究報道卻較少，本研究采用H2O2構建新生SD大鼠心衰模型，并用烏頭堿進行處理后，從MTT法檢測心肌細胞活力等方面觀察烏頭堿對H2O2誘導的心衰模型的拮抗作用，旨在探討烏頭堿對H2O2引起的心衰模型的強心作用量-效、時-效關系，為烏頭堿的開發(fā)應用提供科學實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 動物：新生SD大鼠（24 h內(nèi)），雌雄不限，購自浙江醫(yī)學科學院實驗動物中心，合格證號：SYXK（浙）2008-0113。

1.2 藥物與試劑 烏頭堿標準品（每瓶10 mg，純度≥98%，中國藥品與生物制品鑒定所）；30%過氧化氫 （每瓶 500 mL，純度≥30%，上海遠大過氧化物有限公司）；5′-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brd-U，每瓶 100 mg，純度≥99%，美國 Sigma公司）；二甲基亞砜（DMSO，每板 100 mg，純度≥99.5%，美國 Sigma公司）；臺盼藍（每瓶 5 g，純度≥70%，美國 Sigma公司）；四噻唑蘭（MTT，每瓶1 g，純度>98%，美國 Biosharp 公司）。胎牛血清（FBS，100 mL/瓶，杭州四季青生物工程材料有限公司）；0.25%胰酶+0.02%EDTA（每瓶100 mL，美國GiBco公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基（含雙抗，每瓶 250 mL，美國 GiBco公司）；Ⅱ型膠原酶（100 mg/瓶，美國GiBco公司）；PBS（每瓶250 mL，吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司）。

1.3 儀器 TE2000-S倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；SWCJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；3111型CO2培養(yǎng)箱 （美國Thermo公司）；LDZ5-2型低速自動平衡離心機 （北京京立離心機有限公司）；Model-680型酶標儀 （美國Bio-Rad生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）；THZ-C-1型臺式冷凍恒溫振蕩器（太倉市實驗設備廠）。

1.4 乳鼠心肌細胞的原代培養(yǎng)［2］（1）取新生24 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠，在超凈工作臺內(nèi)用75%酒精浸泡消毒10 s，左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部，然后用75%的酒精棉再次消毒胸部；（2）取眼科剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后再在切口中間橫剪胸骨，左手稍頂，擠出心臟，然后用彎頭眼科鑷夾住心臟中部，即可將心室部分夾下，迅速用預冷的PBS液清洗4～5遍，洗去心室肌表面及血管中殘留的血細胞，放入滅菌10 mL小燒杯中，取眼科直剪將心室肌剪成1 mm3大小的組織碎塊。（3）錐形瓶中加入5倍于組織體積的胰酶（0.1%）消化液，37℃恒溫震蕩8 min后棄上清。剩余組織塊中加入混合消化酶（0.1%胰蛋白酶+0.05%Ⅱ型膠原酶等量加入的混合液）置37℃恒溫震蕩10 min，吸出上清液，加入胎牛血清至上清液中以終止消化，4℃、1000 r/min，離心 10 min，棄上清，加入2 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，吹打成單細胞懸液；剩余的組織塊加入消化酶繼續(xù)消化，取上清液，加胎牛血清，4℃、1000 r/min、離心10 min，棄上清，加入2 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，吹打成單細胞懸液，重復3次，至組織塊大部分消化，成鼻涕狀。（4）將所有單細胞懸液收集到一個離心管中，4℃、1000 r/min，再次離心10 min，棄上清，加入3 mL含0.1 mmol/L Brd-U的10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液充分而輕柔地吹打成單細胞懸液。（5）將單細胞懸液經(jīng)200目尼龍網(wǎng)緩慢過濾去除未消化的組織塊。（6）將濾過的單細胞懸液移入50 mL培養(yǎng)瓶中，按差速貼壁分離法置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1.5 h，輕輕收集尚未貼壁的細胞懸液。（7）將細胞濃度調(diào)至3×105個/mL，0.4%臺盼藍染色，計數(shù)活細胞比率，按每孔150 μL接種至96孔培養(yǎng)板，每孔1 mL接種于24孔培養(yǎng)板，24 h后換不含Brd-U的培養(yǎng)液，然后每2日換一次培養(yǎng)液，培養(yǎng)3～4 d后使用。

1.5 H2O2制造乳鼠心肌細胞心衰模型［3］將H2O2加入10%血清培養(yǎng)液中，使其終濃度為100μmol/L，培養(yǎng)30 min后使用，每次實驗前制備。

1.6 烏頭堿作用于心衰細胞模型 采用均勻設計方案，兩個因素：烏頭堿的濃度、作用時間。采用均勻設計表。

濃度（μmol/L） 10 50 5 25 100時間（h） 0.5 1 2 4 8

（1）倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化：將原代培養(yǎng)的心肌細胞懸液3×105的細胞接種在24孔板，設5組，每組設2復孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，換無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后加入30%的H2O2，使其終濃度為100μmol/L，培養(yǎng)30 min后，加入不同濃度烏頭堿，在一定時間后倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。（2）MTT測細胞活力：將原代培養(yǎng)心肌細胞懸液1×105的細胞接種在96孔板后，設5組，每組8孔，置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，換無血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，然后加入30%的H2O2，使其終濃度為100μmol/L，培養(yǎng)30 min后，加入不同濃度烏頭堿，在一定時間后去掉上清液，每孔加入不含胎牛血清培養(yǎng)基180 μL，0.5%MTT 20 μL，共同培養(yǎng)4 h，去上清液，加入DMSO 150 μL溶解細胞，經(jīng)搖床振搖10 min，于490 nm酶標儀檢測各孔的吸收度（A）值。經(jīng)均勻統(tǒng)計軟件統(tǒng)計后，確定烏頭堿對心衰細胞模型的最佳作用濃度和時間。

1.7 統(tǒng)計學處理 根據(jù)方開泰教授［4］的均勻設計方案，采用均勻設計表 U5（53）。

均勻設計表 U5（53）

使用表：

取S=2，選用均勻設計表中的第1、2水平。均勻設計數(shù)據(jù)用王玉芳老師的均勻統(tǒng)計軟件3.0版統(tǒng)計，建立正確的回歸模型，并通過預測值找出烏頭堿的最佳濃度和最佳作用時間。

2 結 果

2.1 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化

2.1.1 在倒置顯微鏡下觀察，剛接種的心肌細胞尚未貼壁，呈圓形，懸浮于培養(yǎng)液中。培養(yǎng)72 h后，心肌細胞已全部貼壁生長，細胞核凸出明顯，貼壁后細胞為梭形、菱形或多角形，伸出偽足，形成不規(guī)則的星形并形成呈放射狀排列的細胞簇，可出現(xiàn)自發(fā)節(jié)律性搏動。

圖1 原代培養(yǎng)心肌細胞貼壁24 h

圖2 原代培養(yǎng)心肌細胞貼壁72 h

2.1.2 H2O2造模30 min后，細胞偽足縮短，自發(fā)節(jié)律性搏動減少，細胞開始變圓。

圖3 心衰模型

2.1.3 不同濃度烏頭堿作用于心衰細胞模型，其中50μmol/L的烏頭堿作用較明顯，細胞偽足重新伸出，自發(fā)節(jié)律性搏動增加，逐漸恢復梭形、菱形或多角形。

圖4 烏頭堿50μmol/L作用于心衰細胞0.5 h后

2.2 均勻統(tǒng)計結果OD平均值 見下表。

濃度（μmol/L） 10 50 5 25 100時間（h） 0.5 1 2 4 8 OD均值 0.324 0.370 0.288 0.280 0.266

根據(jù)均勻統(tǒng)計軟件的方法統(tǒng)計結果為：

y=0.33+（-2.19e-2）x1+（1.15e-3）x2；

s=9.23e-3r=0.99 f=40.21>F（0.05，2，2）=19.00，回歸方程顯著。

其預測值為：50μmol/L，0.5 h，y=0.376；50μmol/L，1 h，y=0.365；50μmol/L，2 h，y=0.343；25μmol/L，0.5 h，y=0.347；25μmol/L，1 h，y=0.337。

根據(jù)預測50μmol/L的烏頭堿作用0.5 h效果最好。

試驗方法及結果如下表：

50μmol/L烏頭堿在不同時間點對心衰細胞MTTOD值的影響（）

50μmol/L烏頭堿在不同時間點對心衰細胞MTTOD值的影響（）

時間（h） 0 0.1 0.2 0.5 1 2 OD 均值 0.022±0.01 0.322±0.01 10.316±0.003 0.432±0.018 0.313±0.013 0.324±0.05

從上表可看出，經(jīng)統(tǒng)計后所有給藥組同模型組均有顯著性差異，0.1、0.2、1、2 h之間沒有顯著性差異，但同 0.5 h有顯著性差異。

3 討 論

王元、方開泰教授創(chuàng)造的均勻設計法［5］，在國防、科技大型系統(tǒng)工程中應用取得成功。均勻設計將試驗點在高維空間內(nèi)充分均勻分散，使數(shù)據(jù)具有更好的代表性，為揭示規(guī)律創(chuàng)造必要條件。均勻設計的最大特點是，試驗次數(shù)等于最大水平數(shù)，而不是實驗因子數(shù)平方的關系，試驗次數(shù)僅與需要考察的X個數(shù)有關。與正交設計相比，大大減少了實驗次數(shù)，工作量小，實驗結果準確。

烏頭堿是烏頭類有毒中藥的主要藥效成分之一，也是烏頭類有毒中藥化學成分中的毒性成分。藥理學研究表明烏頭及附子對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛作用：對植物神經(jīng)有興奮作用；對心臟系統(tǒng)有明顯的強心及提高缺血心臟做功效率，增加缺血心肌的供氧；對血管系統(tǒng)有升壓和增大血管流量作用；還有抗炎、御寒、免疫抑制和抗腫瘤作用。大量烏頭堿作用于心臟，可出現(xiàn)短暫的收縮力加強，隨即轉入抑制，心肌收縮減弱，心律失常，心臟停止于收縮期，出現(xiàn)嚴重的中毒反應；小量烏頭堿提高耐缺氧能力和抗心肌缺血［6］。烏頭堿可直接毒害心肌細胞，故其心臟毒性的致命性最為嚴重，中毒時極易造成心房纖顫。對于烏頭堿毒性作用的研究較多，而對于其強心作用的量-效、時-效方面的研究較少。

細胞是構成生命的基本單位，任何有害因子對機體的作用，均可通過細胞的形態(tài)與功能的改變表現(xiàn)出來或檢測出來。體外培養(yǎng)的心肌細胞可保持結構及功能上的某些特點，并具有自發(fā)性節(jié)律搏動，且心肌細胞的培養(yǎng)具有可模擬性、重復性好以及不受神經(jīng)體液因素影響等特點，故在探索具有心血管系統(tǒng)藥物的強心作用機制方面具有重要的意義［7］。因此，選用體外心肌細胞培養(yǎng)法研究烏頭堿的強心作用。

心肌細胞凋亡是引起心臟重構，并最終導致心衰的重要因素［8］。有研究［9］顯示 H2O2作為氧化應激刺激劑，能夠誘導體外培養(yǎng)的心肌細胞發(fā)生凋亡。本實驗發(fā)現(xiàn)，使用不同濃度的烏頭堿處理后，可不同程度的改善心肌細胞的生存活力，經(jīng)均勻設計并驗證實驗后，50μmol/L的烏頭堿作用0.5 h效果最佳，希望能為臨床用藥提供理論指導。而烏頭堿的具體作用機制，會在接下來的實驗中從細胞信號轉導變化、細胞內(nèi)活性氧水平、DNA損傷等角度進行研究。

總之，烏頭堿是一種很有前景的抗心衰治療藥物，其具體強心作用機制還有待進一步研究。

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