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2北京太陽(yáng)宮社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）基本病理改變包括：周細(xì)胞選擇性的丟失；基底膜增厚；微血管瘤的形成；內(nèi)皮細(xì)胞增生；新生血管形成。其中周細(xì)胞選擇性的丟失和基底膜的增厚是最早的病理改變。晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）在內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞及基底膜沉積，通過(guò)與其受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）結(jié)合起作用，在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生過(guò)程中起重要作用。本研究以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠為模型，觀察應(yīng)用芪參益氣滴丸對(duì)視網(wǎng)膜AGEs和RAGE mRNA表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性6周齡SD大鼠82只，體重180～220 g。購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。許可證號(hào)SCXK（京）2006-0009。

1.2 藥物和試劑

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美國(guó) sigma 公司出品S0130），購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司。芪參益氣滴丸浸膏（國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030139），由天津天士力制藥股份有限公司提供。陽(yáng)性對(duì)照藥物：羥苯磺酸鈣膠囊（多貝斯膠囊，國(guó)藥準(zhǔn)字X20000713）。反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time（DRR037A），PCR 擴(kuò)增試劑盒（DR001A），購(gòu)自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司。Gene-RulerTMLow Rangge DNA Ladder；AGEs 隨機(jī)引物；一步法抗兔/鼠通用型抗體Ⅱ（AGEs）購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 動(dòng)物模型的建立

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組12只，造模組70只。造模前大鼠禁食12 h，左下腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素，臨用前用pH=4.4檸檬酸緩沖液（4℃保存）冰浴配制成濃度為1%的溶液（質(zhì)量濃度為0.01g/ml），按65mg/kg大鼠體重的劑量使用。正常對(duì)照組注射同等體積的生理鹽水。72 h后取尾靜脈血，用快速血糖儀（羅康全活力型血糖儀）測(cè)量血糖。凡空腹血糖≥16.7 mmol/L者即為糖尿病模型大鼠。

1.4 分組及給藥

造模1周后血糖仍不低于16.7 mmol/L的糖尿病大鼠依血糖水平配對(duì)分成對(duì)照組20只，模型組20只與芪參益氣滴丸組（簡(jiǎn)稱中藥組）30只，并開(kāi)始給藥。實(shí)驗(yàn)期間自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)期10個(gè)月。正常組和模型組喂食普通飼料。對(duì)照組：大鼠每日上午9～10時(shí)灌胃給多貝斯 1次，給藥劑量為 0.2 g/（kg·d）。中藥組大鼠每日上午9～10時(shí)灌胃給藥1次，給藥劑量為 0.2 g/（kg·d）[計(jì)算公式：db=da·Kb/Ka， K人=0.11，K大鼠=0.71，da 為已知人的單位體質(zhì)量（kg）劑量，db為欲換算的動(dòng)物的單位體質(zhì)量（kg）劑量，Kb、Ka為折算系數(shù)。按正常50 kg體質(zhì)量成人每日口服芪參益氣滴丸 1.5 g 計(jì)算，db=（1.5 g/50 kg）×（0.71/0.11）≈0.2 g/kg]。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 制備視網(wǎng)膜切片：乙醚麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈放血處死大鼠。摘除眼球置于4%多聚甲醛固定（4℃，24 h），沿角膜緣剪開(kāi)眼球壁，去除角膜、晶狀體、玻璃體，余下的眼杯放入固定液中再固定48 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度為3 μm。部分石蠟切片蘇木素-伊紅（HE）染色，Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄；部分石蠟切片行免疫組織化學(xué)染色。

1.5.2 視網(wǎng)膜切片免疫組織化學(xué)染色：石蠟切片脫蠟，梯度酒精水化；流水漂洗5 min，PBS洗2次，每次5 min；封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶（0.3%H2O2甲醇液）15 min；流水沖洗 5 min；PBS液洗3次，每次5 min；每張切片滴加阻斷劑50～100 μl作用30 min；不洗，滴加一抗（AGEs：1∶50 多抗），濕盒 4 ℃冰箱過(guò)夜；PBS液洗3次，每次5 min；滴加LSAB二抗，濕盒室溫中90 min；PBS液洗3次，每次5 min；滴加LSAB三抗，濕盒室溫中90 min；PBS液洗3次，每次5 min；0.05%DAB-H2O2顯色液3-5 min，顯色后PBS液終止，水洗5 min；梯級(jí)乙醇脫水，風(fēng)干；DPX封片。

1.5.3 RT-PCR：（1）RNA 提取步驟：每?jī)芍谎垡暰W(wǎng)膜組織加入1mlTrizol，在玻璃勻漿器中勻漿（冰?。?；轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管；冰上放置勻漿混合物5 min，每1 ml Trizol加入0.2 ml三氯甲烷；劇烈混合30 s后，室溫放置3 min；4℃12 000 r/min離心 10 min，可見(jiàn)分層；將上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至一新的離心管中；在吸取的水相中加入0.5 ml異丙醇，輕柔混合均勻，室溫靜置 10 min；4℃ 12 000 r/min離心 10 min，可見(jiàn)少量RNA沉淀；棄上清，用1 ml 75%的乙醇洗滌沉淀 2次；4℃離心沉淀 5 min（Frc=7 500），棄上清；空氣中干燥 RNA 沉淀 5～10 min；20 μl DEPC 水溶解RNA沉淀；取2 μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法測(cè)定RNA純度及濃度；計(jì)算總RNA濃度。（2）RNA反轉(zhuǎn)錄步驟：將溶解后的RNA用DEPC水稀釋至濃度為1μg/ul；取5μl稀釋后的RNA溶液于新的0.5ml離心管中；每 5 μl RNA稀釋液中，分別加入 5×PrimeScriptTM Buffer 4μl，PrimeScriptTMRT Enzyme Mix Ⅰ 1μl，Oligo dT Primer 1 μl，ramdom 6 mers 1μl，RNase Free dH2O 8μl，PCR 總反應(yīng)體積為 20 μl；將反應(yīng)管置于PCR儀，反轉(zhuǎn)錄37℃反應(yīng)15 min，85℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)5 s，4℃終止反應(yīng)10 min；將反轉(zhuǎn)錄完畢所得到的模板DNA，用0.5 ml離心管分裝，分裝成 4管，每管 5 μl；-20℃保存，備用；以上操作均在冰上進(jìn)行。（3）RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增步聚：將模板DNA用雙蒸水1∶5倍稀釋；取稀釋后的模板DNA稀釋液 2 μl至一新 0.5 ml離心管中，每 2 μl模板DNA稀釋液分別加入 TaKaRa Taq 0.1 μl，10×PCR Buffer（Mg2＋Plus） 2 μl，dNTP Mixture 1.6 μl，上、下游引物各 0.4 μl，ddH2O 13.5 μl，PCR 反應(yīng)液總體積為 20 μl（冰浴）；將反應(yīng)管置于PCR儀，擴(kuò)增反應(yīng)94℃預(yù)變性 2 min后，進(jìn)入 94℃變性 30 s，退火 30 s，72℃延伸1min，共32個(gè)循環(huán)（β-actin28個(gè)循環(huán)），最后72℃充分延伸5 min，4℃終止反應(yīng)10 min。引物序列為RAGE：F：5’-GGCCTTCCTCGGCGCAGAC-3’，R：5’-TAGATGCCCTCATCCTCATGC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物 260bp。β-actin：F：5’-CCTGTATGCCTCTGGTCGTA-3’，R：5’-CCATCTCTTGCTCGAAGTCT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物 260bp。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

AGEs表達(dá)的灰度值、RAGE mRNA表達(dá)的光密度值由計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間均值的差異性采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行成組設(shè)計(jì)資料的t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2.1 視網(wǎng)膜AGEs的表達(dá)

視網(wǎng)膜AGEs表達(dá)，模型組明顯高于正常組（P＜0.01），中藥組和對(duì)照組AGEs表達(dá)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），中藥組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 正常組及糖尿病各組大鼠視網(wǎng)膜全層AGEs表達(dá)灰度值的組間比較（±s）

表1 正常組及糖尿病各組大鼠視網(wǎng)膜全層AGEs表達(dá)灰度值的組間比較（±s）

注：AGEs：晚期糖基化終末產(chǎn)物。與對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01。

組別 樣本量 AGEs灰度值正常組 12 0.32±0.05模型組 12 0.65±0.10①對(duì)照組 12 0.37±0.04②中藥組 12 0.37±0.34②

2.2 視網(wǎng)膜RAGE mRNA的表達(dá)

視網(wǎng)膜RAGE mRNA表達(dá)，模型組明顯高于正常組（P＜0.01）；中藥組表達(dá)明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對(duì)照組表達(dá)低于模型組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2、圖 1）。

表2 正常組及糖尿病各組大鼠視網(wǎng)膜RAGE mRNA表達(dá)光密度值的組間比較（±s）

表2 正常組及糖尿病各組大鼠視網(wǎng)膜RAGE mRNA表達(dá)光密度值的組間比較（±s）

注：RAGE：晚期糖基化終末產(chǎn)物受體。與對(duì)照組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01。

組別 樣本量 RAGE mRNA光密度值正常組 12 20.97±6.96模型組 12 85.27±26.27①對(duì)照組 12 69.57±2.91中藥組 12 67.25±4.27②

圖1 RAGE mRNA各區(qū)表達(dá)圖。M為標(biāo)準(zhǔn)組相對(duì)分子質(zhì)量；1、2、3、4分別為β-actin在正常組，模型組，對(duì)照組和中藥組的mRNA表達(dá)；13、14、15、16分別為RAGE在正常組，模型組，對(duì)照組和中藥組mRNA 表達(dá)；β-actin mRNA 為 260 bp，RAGE mRNA 為 260 bp。

3 討論

近年來(lái)研究表明，AGEs的形成與沉積在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生過(guò)程中起重要作用，除使大分子物質(zhì)發(fā)生交聯(lián)導(dǎo)致功能障礙外，可能通過(guò)作用于細(xì)胞上的特異性受體影響細(xì)胞遷徙和基因的表達(dá)。AGEs在內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞及基底膜沉積，從而活化白細(xì)胞，白細(xì)胞在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的異常黏附和浸潤(rùn)，可阻塞視網(wǎng)膜毛細(xì)血管，活化的白細(xì)胞釋放自由基及蛋白酶損傷周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，影響血管通透性及自我調(diào)節(jié)功能〔1〕。被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)吞入的AGEs沉積在基底膜上使其增厚，導(dǎo)致管腔狹窄，同時(shí)也使位于其上的周細(xì)胞功能障礙〔2〕，導(dǎo)致毛細(xì)血管壁功能障礙。AGEs可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)刺激VEGF的產(chǎn)生，引起新生血管形成和血管通透性增加，甚至引起血管壁水腫〔3〕。AGEs的許多功能是通過(guò)RAGE起作用的，RAGE與AGEs結(jié)合后，激活細(xì)胞內(nèi)的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。AGE-RAGE軸激活后增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，一方面使凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax失調(diào)，caspase凋亡途徑激活，細(xì)胞進(jìn)入凋亡，周細(xì)胞凋亡是DR早期典型的病理變化〔4〕。

DR表現(xiàn)出的是本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜證侯，氣虛、陰虛、陽(yáng)虛為本，血瘀、痰凝為標(biāo)。在臨床上視網(wǎng)膜微血管瘤出現(xiàn)之前，AGEs在視網(wǎng)膜沉積，就已發(fā)生基底膜的增厚，內(nèi)皮細(xì)胞增生，周細(xì)胞凋亡等病理改變，這些病理改變從中醫(yī)學(xué)角度看是血瘀、痰凝的表現(xiàn)。許多學(xué)者〔5-7〕對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變中醫(yī)證候分類也進(jìn)行了深入研究，DR早期患者多為氣陰兩虛證。我們?cè)谇捌诎l(fā)現(xiàn)益氣藥物對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜微血管基底膜有保護(hù)作用研究的基礎(chǔ)上〔8〕，選用芪參益氣滴丸早期干預(yù)，芪參益氣滴丸主要由黃芪、丹參、三七、降香組成，功用益氣活血，標(biāo)本兼治，觀察對(duì)AGEs和RAGE表達(dá)的影響。

本研究結(jié)果顯示，芪參益氣滴丸可以使糖尿病大鼠視網(wǎng)膜AGEs和RAGE mRNA的表達(dá)降低，進(jìn)而減少AGEs在內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞及基底膜沉積，減弱AGEs-RAGE的相互作用，減輕毛細(xì)血管壁的功能障礙。其對(duì)視網(wǎng)膜微血管保護(hù)作用可能與此有關(guān)。本研究也為臨床上應(yīng)用中成藥防治DR提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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