康然 黃桂成 李海聲 李青 胡春萍 劉彬彬 戚晴雪 謝林

椎間盤退變隨著年齡的增加而加重，其發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制復(fù)雜，治療棘手[1]。隨著分子生物學(xué)及組織工程技術(shù)的發(fā)展，椎間盤內(nèi)注射生長因子、干細(xì)胞及細(xì)胞支架移植促進(jìn)髓核及纖維環(huán)的再生為椎間盤退變的治療提供了新的途徑[2-3]。制備一種與人類椎間盤結(jié)構(gòu)、大小相似，便于操作，可靠的動物模型作為載體是研究的前提。本研究采用刀刺損傷纖維環(huán)建立了豬腰椎間盤退變模型，同時觀察穿刺針穿刺纖維環(huán)對椎間盤退變的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康雌性家豬6頭(由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供)，3月齡，平均體質(zhì)量(24.00 ±3.54)kg。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備:術(shù)前禁食24 h，腹腔注射3%戊巴比妥1 ml/kg，臀部肌肉注射阿托品0.05mg/kg，動物進(jìn)入較好的麻醉狀態(tài)，行MRI檢查。耳緣靜脈穿刺，建立靜脈輸液通道，血氧監(jiān)護(hù)，推注丙泊酚3mg/kg，氣管插管，丙泊酚20 ml/h、瑞芬太尼15 ml/h靜脈泵入。

1.2.2 手術(shù)方法:實(shí)驗(yàn)豬右側(cè)臥位于透X線手術(shù)臺上，左側(cè)腰腹部常規(guī)備皮、消毒、鋪無菌手術(shù)單。切口以末節(jié)肋骨與脊柱交點(diǎn)前下方2 cm處開始，沿著腰椎橫突的前方3 cm向下，共15 cm。分離腹外斜肌、腹內(nèi)斜肌、腹橫肌至腹膜，沿腹膜后間隙至椎體側(cè)前方，保護(hù)腹膜、腎臟、輸尿管、腹主動脈。“C”臂X線機(jī)透視定位，23號刀片于纖維環(huán)的左前外側(cè)平行于椎間隙刺入至刀柄處，長度為17 mm(術(shù)前椎間盤MRI橫斷面測量，此方向椎間盤直徑35 mm，纖維環(huán)寬6 mm)，停留5 min。或用18號穿刺針沿同樣方向穿刺，深度17 mm，停留5 s。對照組椎間盤只暴露不進(jìn)行穿刺。止血，逐層縫合，包扎傷口，臀部肌肉注射青霉素320萬U。動物清醒后拔管。手術(shù)后2周6只實(shí)驗(yàn)豬再次腹腔注射3%的戊巴比妥，麻醉下行MRI檢查。手術(shù)后4、6周，對其中空白1只進(jìn)行MRI檢查，6周時靜脈內(nèi)注射過量苯巴比妥鈉處死該頭實(shí)驗(yàn)豬，取椎間盤行病理切片檢查。

1.3 指標(biāo)檢測

1.3.1 MRI檢查:應(yīng)用美國GE公司1.5T MRI設(shè)備檢查。參數(shù) O-Sag T2 frFSE:TR=2800，TE=102，ETL=21，Bandwidth=41.67，Mtrix=256 ×480，Nex=2，F(xiàn)OV=32，thickness=3 mm，spacing=0。于正中矢狀位，選擇髓核高信號區(qū)域，測量信號值，即MEANS值。并以同一次檢查的T13～T14椎間盤信號值為基準(zhǔn)，計算各椎間盤的相對信號強(qiáng)度，以消除干擾。相對信號強(qiáng)度=所測椎間盤信號值/T13～T14椎間盤信號值。椎間盤高度以正中矢狀位椎間隙中心為測量點(diǎn)，應(yīng)用Centricity DICOM Viewer中Distance軟件測量。

1.3.2 病理組織學(xué)檢測:實(shí)驗(yàn)動物處死后，取出整段腰椎，沿各椎體中央水平鋸開，然后縱向鋸開，保留完整椎間盤，進(jìn)行大體形態(tài)觀察。甲醛液固定，硝酸脫鈣，石蠟包埋，切成6μm厚的切片。HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.3 統(tǒng)計學(xué)分析:所有數(shù)值采用SPSS軟件統(tǒng)計，椎間盤MRI相對信號強(qiáng)度及椎間盤高度數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋)表示，同組前后對照采用配對t檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，LSD及SNK分析。等級資料采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

6頭實(shí)驗(yàn)豬，末節(jié)胸椎T14至首節(jié)骶椎S1共42個椎間盤，其中對照組9個，針刺模型組8個，刀刺模型組25個。手術(shù)后4周、6周，僅1頭實(shí)驗(yàn)豬的7個椎間盤列入觀察，其中對照組2個，針刺模型組2個，刀刺模型組3個。

2.1 MRI影像變化特征 造模手術(shù)后2周，刀刺模型組椎間盤MRIT2加權(quán)像信號降低、顏色灰暗，髓核縮小，纖維環(huán)面積增大，椎間盤高度降低，其余2組無明顯變化。術(shù)后4周、6周，刀刺模型組椎間盤信號進(jìn)一步降低，顏色變暗變黑，髓核逐漸消失;而另外2組無明顯變化。雖然模型數(shù)量少，但仍可以看出趨勢，見圖1。

圖1 同一頭實(shí)驗(yàn)豬術(shù)前、術(shù)后2周、術(shù)后4周、術(shù)后6周MRIT2加權(quán)像

2.2 椎間盤MRI信號強(qiáng)度及椎間隙高度變化 各組椎間盤MRI信號強(qiáng)度及椎間隙高度數(shù)據(jù)見表1。造模前，各組數(shù)據(jù)無顯著差異。造模手術(shù)后2周刀刺模型組椎間盤相對信號強(qiáng)度與其術(shù)前比較顯著降低(P＜0.01)，與手術(shù)后2周其余2組比較差異亦顯著(P＜0.01)。造模手術(shù)后2周刀刺模型組椎間盤高度與其術(shù)前比較顯著降低(P＜0.01)，與手術(shù)后2周其余2組比較差異亦顯著(P＜0.05)。針刺模型組術(shù)后2周，椎間盤高度稍有降低，但與手術(shù)前比較無差異。

表1 椎間盤MRI信號強(qiáng)度及椎間隙高度變化

表1 椎間盤MRI信號強(qiáng)度及椎間隙高度變化

注:與術(shù)前比較，＊＊P＜0.01;與其他2組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別MRI 相對信號強(qiáng)度 椎間盤高度(mm)術(shù)前 術(shù)后2周 術(shù)前 術(shù)后2周對照組(n=9)1.00±0.08 0.98±0.14 2.82±0.60 2.96±0.77針刺模型組(n=8) 0.99±0.14 0.92±0.12 2.81±0.56 2.44±0.37刀刺模型組(n=25) 0.98±0.13 0.77±0.17＊＊△△ 2.64±0.41 1.98±0.32＊＊△

2.3 椎間盤退變MRI評分 參照Pfirrmann分級系統(tǒng)分級比較[4]。各組椎間盤手術(shù)前均為Ⅰ級，手術(shù)后2周Pfirrmann分級情況，見表2。造模手術(shù)后2周，刀刺模型組相比其他2組退變迅速，差異顯著(P＜0.01)。對照組和針刺模型組之間無明顯差異。

表2 手術(shù)后2周Pfirrmann分級(n，%)

2.4 組織病理學(xué)表現(xiàn) 大體觀察可見對照組及針刺模型組椎間盤髓核組織為透明膠凍狀，椎間隙清晰，纖維環(huán)及髓核的界限清楚(圖2)。刀刺模型組不能分辨髓核組織，纖維環(huán)及髓核無明顯界限(圖3)。鏡下見，對照組及針刺模型組髓核細(xì)胞均勻分布，形態(tài)正常，纖維環(huán)呈板層結(jié)構(gòu);刀刺模型組髓核組織縮小，細(xì)胞密度小，纖維向內(nèi)塌陷，纖維環(huán)板層出現(xiàn)明顯斷裂，并可見纖維環(huán)內(nèi)層有少量毛細(xì)血管生長(圖4)。

圖2 對照組椎間盤組織大體形態(tài)

3 討論

椎間盤退變是臨床常見腰腿痛疾患的主要病因，其機(jī)制復(fù)雜，治療棘手，為脊柱相關(guān)疾病研究的熱點(diǎn)。椎間盤的退變應(yīng)該區(qū)別于椎間盤的生長、老化以及生理適應(yīng)性改造，它應(yīng)該與臨床上的功能障礙和疼痛相關(guān)[5]。年齡增加引起的改變，如細(xì)胞基質(zhì)組成改變，從出生就開始出現(xiàn)[6]，并不和疼痛相關(guān)[7];年齡增加，椎間盤終板血管減少和椎間盤內(nèi)細(xì)胞密度下降，只是反應(yīng)了椎間盤對增加的機(jī)械負(fù)荷和較低代謝轉(zhuǎn)運(yùn)的必要適應(yīng);年齡增加，椎間盤內(nèi)微小裂隙的逐漸增多，這種裂隙在所有的椎間隙水平均存在，并可能在以后的時間里變成更大的裂隙，但只要這種裂隙保持不發(fā)展擴(kuò)大，它對椎間盤的功能就不會有影響[8]。細(xì)胞代謝的指標(biāo)，如細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶活性的變化[9]，它們與椎間盤結(jié)構(gòu)的損壞相關(guān)[10]，如果我們把椎間盤的退變歸咎于這些指標(biāo)，那么就像把戰(zhàn)爭歸咎于士兵一樣。模仿關(guān)鍵病理因素是本研究制備動物模型的思路。

結(jié)構(gòu)的破壞在椎間盤退變中起著決定性的作用，手術(shù)破環(huán)椎間盤終板或纖維環(huán)可以導(dǎo)致椎間盤退行性改變的發(fā)生。終板損傷模型，通過在椎體側(cè)方途徑穿刺終板，引起髓核的壓力降低，蛋白多糖流失和纖維環(huán)內(nèi)層結(jié)構(gòu)的破裂[11]。纖維環(huán)損傷模型，是模仿纖維環(huán)周圍的裂隙，引起繼發(fā)的髓核及終板的改變[12-13]，導(dǎo)致出現(xiàn)椎間盤的退行性表現(xiàn)。向椎間盤內(nèi)生長的神經(jīng)及血管是損傷椎間盤在結(jié)構(gòu)上的重要特點(diǎn)，不同程度上，直接和疼痛相關(guān)[14]。纖維環(huán)后方和后縱韌帶受竇椎神經(jīng)(一種自主神經(jīng)和軀體神經(jīng)的混合神經(jīng)，具有傷害感受器)支配，但在椎間盤的前方以及側(cè)方受自主神經(jīng)的支配。具有傷害疼痛感受器的神經(jīng)纖維僅僅穿越纖維環(huán)最外層的1～3 mm[15]，在嚴(yán)重?fù)p傷的椎間盤中，這些神經(jīng)可以延伸到髓核和椎體的前方，在椎體終板中也有相似密度的神經(jīng)分布[16]。椎間盤內(nèi)正常壓力的喪失，促使了這種生長，降低的蛋白聚糖含量也有助于神經(jīng)和毛細(xì)血管的長入[17-19]。本研究針對椎間盤退變的決定性病理因素，破壞椎間盤結(jié)構(gòu)，刀片切開纖維環(huán)造模，6周后髓核消失，椎間隙變小，髓核陷窩為纖維組織代替，纖維環(huán)內(nèi)出現(xiàn)明顯的裂隙，并有小血管長入纖維環(huán)的內(nèi)層，符合椎間盤退變的病理特征。但未見神經(jīng)長入，可能與神經(jīng)生長緩慢有關(guān)。

MRI已成為診斷椎間盤退行性改變最精確的檢查手段之一[4]。MRI能夠描述椎間盤的水分含量以及形態(tài)學(xué)變化。與退變有關(guān)的椎間盤生化和結(jié)構(gòu)的改變在T2像上表現(xiàn)為髓核信號強(qiáng)度明顯降低，椎間高度下降。由于各節(jié)段椎間盤在磁場中所處的位置存在一定差異和儀器本身存在的不穩(wěn)定因素，參考文獻(xiàn)方法[18]，本研究以正中矢狀位T13～T14正常椎間盤髓核信號作為對照標(biāo)準(zhǔn)，所得相對信號強(qiáng)度值，更加準(zhǔn)確、客觀。本研究中采用23號手術(shù)刀片全程穿刺纖維環(huán)，2周時MRI即可檢測到椎間盤的退行性改變，髓核信號降低，椎間隙高度下降，纖維環(huán)向外、向內(nèi)擴(kuò)展。Pfirrmann分級，刀刺模型組椎間盤出現(xiàn)明顯的退變。采用18號針穿刺纖維環(huán)組沒有上述病理及MRI檢測的明顯變化，可能與豬的椎間盤較大，刺針的直徑未達(dá)到椎間盤高度的40%有關(guān)[19]，同時也說明適當(dāng)大小的穿刺針，可以進(jìn)行椎間盤的穿刺注射治療，對椎間盤無損傷。

椎間盤退變是一個緩慢的過程，在年輕人中，終板損傷需要幾年的時間才能表現(xiàn)出椎間盤退變的現(xiàn)象[20]。動物實(shí)驗(yàn)通過人為的損傷干預(yù)，加快退變過程，可以檢測到椎間盤退變的時間跨度從1周到幾個月[12-14]。本實(shí)驗(yàn)中刀片直接刺穿纖維環(huán)，2周即可從MRI上檢測到退變現(xiàn)象，退變程度集中在PfirrmannⅡ、Ⅲ級，隨著時間的推移逐漸加重。本模型造模周期短，干擾因素少，退變程度較一致，便于進(jìn)行治療干預(yù)療效的比較。

鼠、兔、豬、羊等多種動物被用來進(jìn)行椎間盤退變模型的制備[21-22]。小動物椎間盤退變模型的缺陷是椎間盤具有較高的細(xì)胞密度，較好的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，成年椎間盤中脊索細(xì)胞的存在[23]，這些差別，使得它們具有較好的椎間盤修復(fù)能力，與人類差別較大。豬為大型哺乳動物，其脊柱的形態(tài)及大小與人類相似，是理想的模型來源。豬的椎間盤較大，便于操作，適合進(jìn)行椎體融合，椎間盤的穿刺、注射，纖維環(huán)修復(fù)等研究。此類實(shí)驗(yàn)常為腰椎腹膜后入路，切口較長，大多選擇母豬，因?yàn)槟肛i的輸尿管相比公豬在手術(shù)中更不容易被損傷[24-25]。本實(shí)驗(yàn)中無1例出現(xiàn)輸尿管損傷。

豬的解剖跟人很接近，腹膜后入路暴露椎間盤，臨床脊柱外科醫(yī)師一般很容易操作。造模手術(shù)中動物的麻醉及監(jiān)護(hù)需要充分準(zhǔn)備，由于是大型動物實(shí)驗(yàn)，代價較高，單純使用戊巴比妥腹腔或靜脈注射，麻醉深度較難控制，效果不佳，比較危險，本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)中2頭實(shí)驗(yàn)豬因麻醉意外死亡。而全麻下動物麻醉狀態(tài)良好，相對安全。豬為雜食性動物，胃腸內(nèi)可能殘留影響MRI檢測的雜物，實(shí)驗(yàn)之前必須禁食較長時間，以免影響檢查，同時手術(shù)中予以足夠的靜脈補(bǔ)液。確保動物的安全，是造模成功的前提。

刀刺損傷豬椎間盤纖維環(huán)可以在較短的時間內(nèi)成功建立椎間盤退變模型。MRI及病理表現(xiàn)與人類的椎間盤退變相似。手術(shù)操作相對簡單，易于復(fù)制，模型個體間差異小，造模成功率高。與人類相仿的椎間盤形態(tài)及大小，為進(jìn)行椎間盤退變的穿刺注射治療，髓核、纖維環(huán)及終板的再生研究提供了合適的實(shí)驗(yàn)載體。

[1]馬榮連，金宏柱.綜合治療老年腰椎間盤突出癥的回顧及分析[J].實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2007，21(4):273-274.

[2]Yoshikawa T，Ueda Y，Miyazaki K，etal.Disc regeneration therapy using marrow mesenchymal cell transplantation:a report of two case studies[J].Spine，2010，35(11):475-480.

[3]Freimark D，Czermak P.Cell-based regeneration of intervertebral disc defects:Review and concepts[J].Int JArtif Organs，2009，32(4):197-203.

[4]吳劍宏，阮狄克.腰椎間盤退變的MRI診斷分級及其臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].中國脊柱脊髓雜志，2010，20(6):511-515.

[5]AdamsMA，Roughley PJ.What is intervertebral disc degeneration，and what causes it[J].Spine，2006，31(18):2151-2161.

[6]Boos N，Weissbach S，Rohrbach H，etal.Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs:2002 Volvo Award in basic science[J].Spine，2002，27(23):2631-2644.

[7]Battie MC，Videman T，Parent E.Lumbar disc degeneration:Epidemiology and genetic influences[J]. Spine，2004，29(23):2679-2690.

[8]Adams MA，McNally DS，Dolan P.‘Stress’distributions inside intervertebral discs，the effects of age and degeneration[J].JBone Joint Surg，1996，78(6):965-972.

[9]Le Maitre CL，F(xiàn)reemont AJ，Hoyland JA.Localization of degradative enzymes and their inhibitors in the degenerate human intervertebral disc[J].J Pathol，2004，204(1):47-54.

[10]Weiler C，Nerlich AG，Zipperer J，etal.2002 SSE Award Competition in Basic Science:Expression of major matrix metalloproteinases is associated with intervertebral disc degradation and resorption[J].Eur Spine，2002，11(4):308-320.

[11]Holm S，Holm AK，Ekstrom L，etal.Experimental disc degeneration due to endplate injury[J].Spinal Disord Tech，2004，17(1):64-71.

[12]胡鵬，劉勇，胡有谷，等.一種羊腰椎間盤退變模型的建立[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，43(2):167-168.

[13]羅平，劉玉林，陳仲.纖維環(huán)穿刺法與纖維環(huán)切開法建立兔椎間盤退變模型[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(11):1955-1958.

[14]Freemont AJ，Peacock TE，Goupille P，etal.Nerve ingrowth into diseased intervertebral disc in chronic back pain[J].Lancet，1997，350(9072):178-781.

[15]Palmgren T，Gronblad M，Virri J，etal.An immunohistochemical study of nerve structures in the anulus fibrosus of human normal lumbar interver-tebral discs[J].Spine，1999，24(20):2075-2079.

[16]Fagan A，Moore R，Vernon Roberts B，etal.ISSLS Prize Winner:The innervation of the intervertebral disc:A quantitative analysis[J].Spine，2003，28(23):2570-2576.

[17]Melrose J，Roberts S，Smith S，etal.Increased nerve and blood vessel ingrowth associated with proteoglycan depletion in an ovine anular lesionmodelof experimental disc degeneration[J].Spine，2002，27(12):1278-1285.

[18]叢琳，屠冠軍.退行性變腰椎間盤 MRI信號強(qiáng)度與aggrecan含量的相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，38(9):687-689.

[19]Elliott DM，Yerramalli CS，Beckstein JC，etal.The effect of relative needle diameter in puncture and sham injection animalmodels of degeneration[J].Spine，2008，33(6):588-596.

[20]Kerttula LI，Serlo WS，Tervonen OA，etal.Post-traumatic findings of the spine after earlier vertebral fracture in young patients:Clinical and MRIstudy[J].Spine，2000，25(9):1104-1108.

[21]Lotz JC，Colliou OK，Chin JR，etal.Compression-induced degeneration of the intervertebral disc:An in vivo mouse model and finite-element study[J].Spine，1998，23(23):2493-506.

[22]戚晴雪，康然，謝林.腰椎間盤退變動物模型建立的國內(nèi)外研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，13(2):79-81.

[23]Lotz JC.Animalmodels of intervertebral disc degeneration:Lessons learned[J].Spine，2004，29(23):2742-2750.

[24]Li H，Zou X，Springer M，etal.Instrumented anterior lumbar interbody fusion with equine bone protein extract[J].Spine，2007，32(4):E126-E129.

[25]Xue Q，LiH，Zou X，etal.Alendronate treatment improves bone—pedicle screw interface fixation in posterior lateral spine fusion:An experimental study in a porcinemodel[J].Int Orthop，2010，34(3):447-451.