朱良全，李聰研，蔣玉文，田冬青，孫 曄

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.北京中海生物科技公司，北京 100081)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridum perfringens)，又稱魏氏梭菌(Clostridum welchii)，依據(jù)其主要致死性毒素與其抗毒素中和試驗(yàn)，可將此菌分為A、B、C、D和E 5個(gè)型[1]。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridum perfringens)是引起動(dòng)物出血性、壞死性腸炎和腸毒血癥的主要病原菌。特別對(duì)新生幼畜和幼禽(尤其是新生仔豬)，易引起高致病性和高死亡率。其主要的毒力因子為α、β1和β2毒素，這3種毒素毒力均很強(qiáng)，且均具有良好的免疫原性[2-3]。

目前，我國(guó)C型產(chǎn)氣莢膜梭菌病滅活疫苗生產(chǎn)采用的厭氣肉肝湯或肉肝胃酶(膜)消化湯培養(yǎng)基存在以下突出問(wèn)題[4]:①成分復(fù)雜，難以標(biāo)準(zhǔn)化;②廣譜性高，專一性弱;③制作繁瑣，需經(jīng)驗(yàn)因素。鑒于此，本試驗(yàn)在研制成功C型產(chǎn)氣莢膜梭菌合成培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，進(jìn)行C型合成培養(yǎng)基使用參數(shù)及培養(yǎng)毒素濃縮工藝的研究，為生產(chǎn)工藝的技術(shù)革新奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 C型產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC60102株(原C59-2株)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種保藏室鑒定、保管和供應(yīng)。

1.1.2 培養(yǎng)基及溶液 厭氣肉肝湯，批號(hào)20091223;肉肝胃酶消化湯，批號(hào)分別為20100105、20100112、20100119;明膠緩沖液(稀釋毒素用)，批號(hào)20100201。由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌合成培養(yǎng)基主要成分為蛋白胨、酵母粉、硫乙醇酸鈉、半胱氨酸鹽酸鹽等，批號(hào)201011，由北京中海生物科技有限公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小白鼠，CD-1品系，16～20 g，SPF級(jí)，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.1.4 濃縮設(shè)備 Easy-load蠕動(dòng)泵，MODEL，NO.XX80EL230;PERMEATE，CAT，NO:X142POO.80;0.5 m2的8 ku及10 ku截留分子量(MW)超濾膜來(lái)自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC60102株種子液的制備 將C型產(chǎn)氣莢膜梭菌(CVCC60102)凍干菌種用1 mL肉肝胃酶消化湯稀釋后，吸取菌液0.1 mL接種于10 mL的肉肝胃酶消化湯中，置37℃靜置培養(yǎng)18～24 h，作為種子液。

1.2.2 菌液的培養(yǎng) 按說(shuō)明書稱取C型合成培養(yǎng)基，用相應(yīng)體積的去離子水將各成分充分溶解，調(diào)pH值至8.3，116℃滅菌30 min，待溫度降至室溫，將種子液按培養(yǎng)基體積的1%接種，37℃靜置培養(yǎng)18 h。

1.2.3 毒素的制備 培養(yǎng)好的菌液以3000 r/min離心30 min，吸取上清，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，即為毒素，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 菌液毒力(MLD)的測(cè)定 將毒素用明膠緩沖液作適當(dāng)稀釋，使0.2 mL稀釋液中分別含有0.001 mL(200×稀釋)、0.002 mL(100×稀釋)、0.003 mL(66×稀釋)和 0.004 mL(50×稀釋)的毒素，各靜脈注射16～20 g的小白鼠2只，每只0.2 mL，在24 h內(nèi)全部死亡的最大稀釋度乘以5，即為每1 mL毒素所含的最小致死量(MLD)數(shù)。

1.2.5 pH值對(duì)合成培養(yǎng)基產(chǎn)毒的影響 配制C型培養(yǎng)基溶液各1000 mL，用2 mol/L氫氧化鈉溶液分別調(diào)整 pH 值至 7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6，116 ℃ 滅菌 30 min。然后按 1.2.2、1.2.3、1.2.4項(xiàng)方法進(jìn)行培養(yǎng)及毒力測(cè)定，各進(jìn)行3批，批號(hào)分別為 C1001、C1002、C1003。

1.2.6 高壓滅菌對(duì)合成培養(yǎng)基產(chǎn)毒的影響 配制C型培養(yǎng)基溶液各1000 mL，用2 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH值至8.3.分別以116℃滅菌30 min、121℃滅菌15 min、121℃滅菌30 min。然后按1.2.2、1.2.3、1.2.4項(xiàng)方法進(jìn)行培養(yǎng)及毒力測(cè)定，共進(jìn)行3批，批號(hào)分別為 C1011、C1012、C1013。

1.2.7 配制用水對(duì)合成培養(yǎng)基產(chǎn)毒的影響 對(duì)C型合成培養(yǎng)基分別用去離子水、反滲透純化水、蒸餾水配制成1000 mL，用2 mol/L氫氧化鈉溶液預(yù)先調(diào)整pH至8.3。然后按1.2.2、1.2.3、1.2.4項(xiàng)方法進(jìn)行培養(yǎng)及毒力測(cè)定，共進(jìn)行3批，批號(hào)分別為 C1021、C1022、C1023。

1.2.8 合成培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的確定 按說(shuō)明書配制C型培養(yǎng)基6瓶，1000 mL/瓶，將種子液按培養(yǎng)基體積的1%接種，其中1瓶置37℃培養(yǎng)20 h，期間分別于 6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h 先后取樣5 mL;另外5 瓶，分別置 35、36、37、38、39、40 ℃培養(yǎng)18 h后取樣5 mL，然后按1.2.3、1.2.4項(xiàng)方法取其上清進(jìn)行毒力測(cè)定，確定最佳產(chǎn)毒的時(shí)間和培養(yǎng)溫度。

1.2.9 配制成的培養(yǎng)基與傳統(tǒng)培養(yǎng)基對(duì)比試驗(yàn)按上述篩選條件配制 C型培養(yǎng)基3批，1000 mL/批，批號(hào)為 C201001、C201002、C201003，與3 批肉肝胃膜消化湯進(jìn)行比較。然后按1.2.2、1.2.3、1.2.4項(xiàng)方法進(jìn)行培養(yǎng)及毒力測(cè)定。

1.2.10 C型合成培養(yǎng)基濃縮工藝的優(yōu)化 配制C型培養(yǎng)基5000～6000 mL，并按上述優(yōu)化條件培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC60102株，培養(yǎng)好菌液經(jīng)3000 r/min離心30 min，去除菌體，分別用不同截留分子量的millipore超濾濃縮系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，然后進(jìn)行濃縮前、后體積定量，并取濃縮前、后及透出液樣品各10 mL按1.2.4項(xiàng)方法進(jìn)行毒力測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 C型產(chǎn)氣莢膜梭菌合成培養(yǎng)基pH值、高壓條件、培養(yǎng)用水優(yōu)化 結(jié)果如表1、表2和表3所示。從表1、表2和表3結(jié)果可以看出，最適pH值為8.0～8.4，滅菌條件為116℃、30 min，配制用水為去離子水。

表1 不同pH值培養(yǎng)基的產(chǎn)毒結(jié)果(MLD/mL)

表2 不同高壓條件培養(yǎng)基的產(chǎn)毒結(jié)果(MLD/mL)

2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)溫度 產(chǎn)毒結(jié)果如表4、表5所示。從表4和表5結(jié)果看出，合成培養(yǎng)基培養(yǎng)CVCC60102株18 h毒力達(dá)500～1000 MLD/mL，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，毒力不再增強(qiáng);培養(yǎng)溫度為36℃或37℃，產(chǎn)毒效果最佳。

表3 不同配制用水條件下培養(yǎng)基產(chǎn)毒結(jié)果MLD/mL

表4 不同培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)毒結(jié)果 MLD/mL

表5 不同培養(yǎng)溫度下產(chǎn)毒結(jié)果 MLD/mL

2.3 合成培養(yǎng)基與肉肝胃膜消化湯對(duì)比 結(jié)果見(jiàn)表6。從表6看出，C型合成培養(yǎng)基可替代傳統(tǒng)培養(yǎng)基。

2.4 培養(yǎng)毒素濃縮條件優(yōu)化 結(jié)果見(jiàn)表7。從表7看出，10 ku截留分子量的收獲率為68%，其透出液靜脈接種0.2 mL，小鼠2/2死亡;而8 ku收獲率達(dá)80%，其透出液靜脈接種0.2 mL，小鼠0/2死亡。

表6 合成培養(yǎng)基和肉肝胃酶消化湯毒力比較結(jié)果

表7 不同截留分子量的膜包濃縮結(jié)果

因此8 ku截留分子量的膜包適宜對(duì)C型菌培養(yǎng)毒素的濃縮。

3 小結(jié)與討論

3.1 α、β1和β2毒素是C型產(chǎn)氣莢膜梭菌主要分泌毒素，也是主要免疫原，其分子量分別為42.5、34.5、28 ku[1，5]。影響毒素產(chǎn)量因素較多，比如菌株類型、菌株毒力、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)過(guò)程中的溶解氧和培養(yǎng)基組成及各組分的比例等[6]。通過(guò)對(duì)C型合成培養(yǎng)基使用參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)，確定最適pH值為8.0～8.4;滅菌方式為116℃、30 min;配制用水為去離子水;合成培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC60102株18 h后毒力達(dá)500～1000 MLD/mL，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，毒力不再增強(qiáng);培養(yǎng)溫度在36℃或37℃時(shí)，產(chǎn)毒效果最佳。合成培養(yǎng)基按照細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)代謝特點(diǎn)設(shè)計(jì)，添加了促進(jìn)菌體增殖、提高產(chǎn)毒性能的生長(zhǎng)因子，具有產(chǎn)毒量高、成分相對(duì)確定、質(zhì)量穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，易于在線檢測(cè)、監(jiān)控和及時(shí)調(diào)整。上述數(shù)據(jù)為C型合成培養(yǎng)基的應(yīng)用提供了使用參數(shù)。

3.2 超濾濃縮具有樣品量大、處理快速、重復(fù)利用率高等特點(diǎn)，適合大規(guī)模生產(chǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于獸用生物制品疫苗的生產(chǎn)。在完成A型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)毒素濃縮工藝的基礎(chǔ)上，開展了C型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)毒素濃縮工藝的優(yōu)化。分別用不同分子截留量的millipore超濾濃縮系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，10 ku截留分子量收獲率為68%，其透出液含毒素，且能致死小鼠;8 ku截留分子量的收獲率達(dá)80%，其透出液不含毒素，因此用8 ku截留分子量膜包適宜對(duì)C型菌培養(yǎng)毒素進(jìn)行濃縮，這與A型菌一致。但本試驗(yàn)濃縮僅達(dá)12.5倍，耗時(shí)需60 min，濃縮倍數(shù)遠(yuǎn)低于A型，而且耗時(shí)長(zhǎng)于A型(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，可能由于C型菌同時(shí)主要含有α、β1和β2三種毒素，另外β1和β2毒素分子量相對(duì)低，截留后很快產(chǎn)生較高的濃度，因而耗時(shí)長(zhǎng)。因C型菌所產(chǎn)毒素毒力強(qiáng)，每毫升致死量是A型的5～10倍，因而12.5倍濃縮效果足夠進(jìn)行禽壞死性腸炎滅活疫苗和多價(jià)梭菌滅活苗的研制和生產(chǎn)。

3.3 通過(guò)完善A型及C型產(chǎn)氣莢膜梭菌合成培養(yǎng)基的使用參數(shù)及培養(yǎng)毒素濃縮工藝，為下一步開展禽壞死性腸炎(A型+C型)二價(jià)滅活疫苗研究奠定了基礎(chǔ)。

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