馬繼花，張 萍，石彥鵬，張亞強

(寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所，銀川 750101)

延胡索酸泰妙菌素(Tiamulin Fumarate)是由高等真菌擔子菌側耳屬(Pleuroutus mutilus)通過發(fā)酵得到截短側耳素后，再經過化學合成得到的氫化延胡索酸鹽，是一種雙萜烯類獸用抗生素。本品抗菌譜與大環(huán)內酯類抗生素相似，主要抗革蘭氏陽性菌，對金黃色葡萄球菌、鏈球菌、支原體、豬胸膜肺炎放線桿菌、豬密螺旋體痢疾等有較強的抑制作用，對支原體的作用強于大環(huán)內酯類;對革蘭氏陰性菌尤其是腸道菌作用較弱。其主要用于防治雞的慢性呼吸道病、豬支原體肺炎、放線菌性胸膜肺炎和密螺旋體性痢疾等，低劑量可以促進生長，提高飼料利用率。最新研究表明，泰妙菌素與抗腫瘤藥物聯(lián)用可增強腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的敏感性，顯示了其在腫瘤治療方面的潛在價值[1]。目前泰妙菌素菌種的生產能力較低，發(fā)酵產量低，不能滿足發(fā)酵行業(yè)生產的需要，因此，提高泰妙菌素的產量是生產企業(yè)亟待解決的問題，而選育泰妙菌素高產菌株是行之有效的方法。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基是實驗室里使用最普遍的真菌培養(yǎng)基，它也被廣泛應用于食用菌母菌的培養(yǎng)中[2]。同樣作為真菌的擔子菌側耳屬的泰妙菌素產生菌，能否在該培養(yǎng)基上生長并體現出它獨有的優(yōu)勢，本文以生產用的麥芽浸膏培養(yǎng)基為對照，通過對菌種的分離、篩選以及采用HPLC法測定泰妙菌素的含量，最終獲得了4株高于對照的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 菌株TMⅡ10-444由寧夏泰瑞制藥股份有限公司菌種研究所分離純化獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)基;麥芽浸膏培養(yǎng)基:葡萄糖、麥芽浸膏、酵母膏、瓊脂粉;馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂粉;種瓶培養(yǎng)基:葡萄糖、硝酸鈣、消泡劑;發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖、玉米漿、豆油。均參照寧夏泰瑞制藥股份有限公司企業(yè)內控標準。

1.1.3 試劑 酵母膏和麥芽浸膏，北京奧博星生物技術有限公司;瓊脂粉，青島凍粉廠;玉米漿，華北制藥康欣有限公司;硝酸鈣、硫酸鎂、葡萄糖等均為分析純試劑。

1.1.4 儀器與設備 Waters2695/2487型高效液相色譜儀，美國Waters公司;C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);XDW25/96 型旋轉搖瓶機，樂山長征制藥機械有限公司;凈化工作臺，無錫市榮豐凈化空調設備廠;恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2 方法

1.2.1 使用菌株的選擇 選擇TMⅡ10-444作為出發(fā)菌株，用麥芽浸膏培養(yǎng)基進行分離純化，搖瓶效價為14046 U/mL。

1.2.2 平板培養(yǎng)基的制備 麥芽浸膏培養(yǎng)基:用電子天平(精度0.001 g)準確稱取培養(yǎng)基所需量的葡萄糖、麥芽浸膏和酵母膏，加純化水攪拌使其充分溶解，再加入瓊脂粉，并加熱溶解至透亮，將溶液倒入量筒中補充純化水至所需體積，攪拌均勻后分裝于750 mL三角瓶中，于120～121℃、0.10～0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，在凈化工作臺上制備成平板，待用。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基:取新鮮馬鈴薯洗凈去皮，切塊后加純化水適量煮沸30 min，然后用4層紗布過濾取汁，稱取葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、維生素B1微量，逐個用純化水溶解，再加入瓊脂粉，加熱溶解并補足體積至1 L，攪拌均勻后分裝于750 mL三角瓶中，于120～121℃、0.10～0.11 MPa高壓蒸汽滅菌30 min，在凈化工作臺上制備成平板，待用。

1.2.3 稀釋平板分離 鏟取斜面菌絲，置于加有生理鹽水的研磨器中，研磨至混濁、無片狀菌絲，吸取菌懸液1 mL，按照10倍稀釋法用生理鹽水稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，依次涂布于制備的兩種不同平板培養(yǎng)基上，工藝條件下置恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d，觀察平板生長情況。

1.2.4 單菌落篩選

1.2.4.1 挑選單菌落 分別挑取兩種平板上生長成熟的單菌落接種于麥芽浸膏斜面培養(yǎng)基上，制備成斜面，其中馬鈴薯葡萄糖平板上挑取單菌落86支，麥芽浸膏平板上挑取單菌落77支，斜面上標注單菌落編號后置于同一培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日定時觀察單菌落的生長情況，并記錄生長過程。

1.2.4.2 初篩 以出發(fā)菌株在麥芽浸膏培養(yǎng)基上制備的斜面作為對照，將培養(yǎng)好的單菌落斜面對號接入發(fā)酵瓶，一支斜面接一個發(fā)酵瓶，同時放置同一搖瓶機上，于工藝條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后取發(fā)酵液用甲醇1∶9稀釋提取后，測定其HPLC效價。

1.2.4.3 復篩 根據初篩結果從馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中選出8支菌株進行復篩，從麥芽浸膏培養(yǎng)基中挑選出4支菌株進行復篩(以出發(fā)菌株在麥芽浸膏培養(yǎng)基上制備的斜面作為對照)，復篩采用二級發(fā)酵，一支斜面接一個種子瓶，培養(yǎng)成熟后接入發(fā)酵瓶培養(yǎng)基，每個種子瓶平行接三個發(fā)酵瓶，連續(xù)復篩2批，搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后取發(fā)酵液用甲醇1∶9稀釋提取后，測定其HPLC效價。

1.2.5 傳代穩(wěn)定性驗證 將保藏的4株單菌落斜面進行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳三代，待斜面培養(yǎng)成熟后進行搖瓶驗證。同復篩驗證方法，連續(xù)驗證2批。對照組同1.2.4.3項。比較并分析其相對標準偏差(RSD)值，判斷其穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 菌落形態(tài)及個體形態(tài)的觀察 從不同平板培養(yǎng)基上選擇不同類型菌落進行記錄，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板上長出的菌落表面干燥，外觀形態(tài)大而疏松，菌絲相互交織，粗而分化，菌落不透明，菌落與培養(yǎng)基之間粘合牢固，較難研磨，培養(yǎng)11～12 d可以挑取單菌落，培養(yǎng)11 d時單菌落外觀形態(tài)見圖1。對照組麥芽浸膏培養(yǎng)基平板上長出的菌落表面干燥，但菌落的外觀形態(tài)較小而致密，菌絲相互交織，粗而分化，菌落不透明，菌落與培養(yǎng)基之間粘合牢固，比較好研磨，培養(yǎng)13～14 d可以挑取單菌落，培養(yǎng)11 d時單菌落外觀形態(tài)見圖2。

圖2 麥芽浸膏培養(yǎng)基平板11 d菌落形態(tài)

圖1 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板11 d菌落形態(tài)

2.2 初篩驗證結果 從馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基平板上挑取86株單菌落，擴培到麥芽浸膏培養(yǎng)基上制成斜面，經搖瓶初篩驗證有11株效價高于對照，高效價菌株占總挑選數的12.8%;同時從麥芽浸膏培養(yǎng)基上挑取77株單菌落，擴培到麥芽浸膏培養(yǎng)基上制成斜面，經搖瓶初篩驗證有5支效價高于對照，高效價菌株占總挑選數的6.5%。根據初篩驗證效價，挑選出馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基選育的8支效價較高的菌株 2107、2115、2154、2165、2183、2189、2201、2216和麥芽浸膏培養(yǎng)基選育的4支效價較高的菌株 2253、2262、2283、2289 進行復篩驗證。

2.3 復篩驗證結果 如表1所示，從復篩效價分析，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上選育的8支菌株，其復篩驗證效價均高于麥芽浸膏培養(yǎng)基上選育的4支菌株，且高于對照組，經過兩次復篩搖瓶驗證，將2107、2115、2165、2183 共 4 支單菌落斜面用液體石蠟覆蓋保藏。

表1 復篩驗證結果 U/mL

2.4 篩選菌株穩(wěn)定性驗證結果 從表2中的數據可以得出，2107、2115、2165和2183共4支菌株的第三代傳代斜面其驗證效價均高于出發(fā)株斜面(對照)，而且RSD值較小，說明這4支菌株傳代穩(wěn)定性較好。

表2 穩(wěn)定性驗證結果

3 討論

3.1 自然選育作為菌種選育中的一種重要手段，具有顯著的優(yōu)勢，其操作簡單，可通過肉眼觀測以及測定發(fā)酵產物成分即可選育出效價高的菌株，在工業(yè)生產中應用廣泛。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作為常見的真菌培養(yǎng)基，搖瓶驗證表明馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基適用于延胡索酸泰妙菌素產生菌的生長。通過涂布法將TMⅡ10-444菌株分離在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基和麥芽浸膏培養(yǎng)基上，置于同一生長條件下培養(yǎng)，每天定時觀察其生長情況并記錄菌株生長過程，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基可以使菌種的生長周期從麥芽浸膏培養(yǎng)基上的14 d縮短到11 d，有效地縮短了選育周期，提高了選育的效率。

3.2 對于生產的菌種而言，其穩(wěn)定性必須得到保證，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基所選育的菌種傳代培養(yǎng)結果顯示穩(wěn)定性表現良好，并且比正常生產的搖瓶效價高，初步表明其可用于生產。

3.3 由于麥芽浸膏在培養(yǎng)基中的用量大、價格昂貴，極大地增加了生產成本;而馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基使用的原料主要為馬鈴薯、葡萄糖等，成本較低，而且選育周期比麥芽浸膏培養(yǎng)基縮短3～4 d，綜合比較，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基具有一定的優(yōu)勢，其可以成為延胡索酸泰妙菌素產生菌菌種選育的一種新方法。

[1]鄒 懿，黃宇琪，胡昌華.截短側耳素及其衍生物的研究進展[J].中國抗生素雜志，2009，34(2):65-68.

[2]董洪梅，王新風.PDA培養(yǎng)基的微波滅菌研究[J].北方園藝，2005，(1):71-72.