高 玲，張 丹，曹 軍，郭 棟，楊瑞章，于伯華

(1.鹽城出入境檢驗(yàn)檢疫局檢測(cè)中心，江蘇鹽城 224002;2.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局，南京 200001)

抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中廣泛的作為治療藥物使用，在眾多抗生素類藥物添加劑中，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素占有較為重要的地位[1]?？股貧埩羰侵敢騽?dòng)物在接受抗生素治療或食入抗生素飼料添加劑后，抗生素及其代謝物在動(dòng)物的組織及器官內(nèi)蓄積或貯存。食品殘留發(fā)生急性中毒的可能性極小，這種長(zhǎng)期、低水平的接觸方式主要產(chǎn)生各種慢性、蓄積毒性，如“三致(致癌、致畸、致突變)”、免疫毒性、發(fā)育毒性和生態(tài)毒性等，對(duì)健康和環(huán)境的危害往往具有隱蔽性，易造成實(shí)質(zhì)性和難以扭轉(zhuǎn)的危害[2]。

目前，國(guó)外對(duì)動(dòng)物性食品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的殘留檢測(cè)開(kāi)展的比較廣泛，已有較多文獻(xiàn)對(duì)此進(jìn)行了研究與探討，而國(guó)內(nèi)相關(guān)檢測(cè)文獻(xiàn)較少，僅有少數(shù)有關(guān)HPLC分析某一種大環(huán)內(nèi)酯[3-4]或LCMS/MS進(jìn)行大環(huán)內(nèi)酯多殘留檢測(cè)[5-6]的報(bào)道，但目前國(guó)內(nèi)液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的研究報(bào)道較少。本文通過(guò)對(duì)比3種水產(chǎn)品中不同的大環(huán)內(nèi)酯類類藥物提取方法，最終利用乙腈超聲提取，能夠快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)水產(chǎn)品中的10中大環(huán)內(nèi)酯類藥物。大量的進(jìn)出口水產(chǎn)品樣品檢測(cè)結(jié)果表明，該方法能夠滿足目前進(jìn)出口已經(jīng)國(guó)家殘留監(jiān)控的標(biāo)準(zhǔn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料 Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra液相色譜-高分辨串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧電離源。

甲醇、乙腈 (色譜純，Merck)，甲酸(色譜純，F(xiàn)luka)，碳酸鈉、碳酸氫鈉 (分析純，南京化學(xué)試劑廠)，水為重蒸蒸餾水。

螺旋霉素Ⅰ(Spiramycin I SPR)、替米考星(Tilmicosin TIL)、林可霉素(Lincomycin LINCO)、紅霉素(Erythromycin ERM)、羅紅霉素(Roxithromycin ROM)、泰樂(lè)菌素 A(Tylosin TYL)、吉他霉素(Kitasamycin KIT)、交沙霉素(Josamycin JOS)、竹桃霉素(Oleandomycin OLE)、克林霉素 (Clindamycin CLN)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，純度＞98%。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品，使用甲醇溶解，得到質(zhì)量濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液:使用甲醇-水(體積比為3∶7)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至所需的質(zhì)量濃度。

水產(chǎn)品樣品為各地送檢樣品。

1.2 HPLC-MS/MS條件 HPLC條件:Hypersil Gold C18 色譜柱 (100 mm ×2.1 mm，5 μm);流動(dòng)相A相為甲醇，流動(dòng)相B相為0.1%甲酸水溶液，流速0.25 mL/min，梯度洗脫程序見(jiàn)表1;柱溫為室溫;進(jìn)樣體積為20 μL;分析時(shí)間為12 min。

表1 大環(huán)內(nèi)酯類藥物色譜分離的線性梯度洗脫程序

MS/MS條件:電噴霧離子化源，正離子方式檢測(cè);10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物質(zhì)譜定性定量數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。1.3 樣品提取 準(zhǔn)確稱取組織(鮰魚(yú)、龍蝦)樣品(5.00±0.05)g于50 mL離心管中，加入相應(yīng)濃度的混標(biāo)渦旋20 s，加入20 mL乙腈提取液，渦旋后超聲提取15 min，再加入4 g無(wú)水硫酸鈉旋渦3 min，離心(3500 r/min，10 min)，殘?jiān)?10 mL 提取液再提取一次，合并濾液。于水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，準(zhǔn)確加入1.00 mL甲醇水混合溶液(體積比2∶8)和0.5 mL正己烷渦旋后高速離心(12000 r/min，10 min)脫脂，取下層清液過(guò)0.45 μm的濾膜到進(jìn)樣瓶中，準(zhǔn)備進(jìn)樣。

表2 10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的母離子和選擇離子及碰撞能

2 結(jié)果與討論

2.1 提取和凈化方式的選擇 大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為弱堿性化合物，易溶于酸性水溶液和極性溶劑，如甲醇、乙腈等[7]。在中性水溶液中相對(duì)較穩(wěn)定，但酸性條件下易發(fā)生水解，特別是紅霉素，即使很稀的醋酸溶液也能使其分解。根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道，采用酸化的甲醇溶液提取，結(jié)果表明，林可霉素、紅霉素、螺旋霉素和阿奇霉素的回收率均小于60%，可見(jiàn)這4種化合物的酸解較為嚴(yán)重。本研究采用乙腈提取，正己烷凈化[10]，10種大環(huán)內(nèi)酯類化合物均得到較好的回收率，且前處理步驟簡(jiǎn)單。

本文還對(duì)比了液-液萃取和固相萃取方法。液-液萃取的方法簡(jiǎn)單方便，但雜質(zhì)較多。固相萃取方法相對(duì)成本較高但提取和凈化一步完成有利用于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作。水產(chǎn)品樣品用0.1 mol/L Na2CO3-NaHCO3(pH=9.3)緩沖溶液提取，然后在Oasis HLB柱上凈化。大環(huán)內(nèi)酯類藥物在酸性條件下(pH＜4.0)不穩(wěn)定，而在堿性條件下(pH=9.3)提取，既可以避免藥物分解，又可以使帶氨基的藥物保持分子形式，提高藥物的固相萃取回收率和穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)獲得的回收率與上法相差不大。考慮到乙腈直接提取方法在大環(huán)內(nèi)酯類藥物提取上已經(jīng)能夠獲得足夠的回收率，且可以較大降低檢測(cè)成本，因此后面都采取了乙腈直接提取的前處理方法。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化 在正離子模式下，分別對(duì)1 mg/L的10種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行母離子全掃描，確定其分子離子，優(yōu)化各分子離子的錐孔電壓。再分別以上述離子為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，選擇豐度較高、干擾較小的兩對(duì)子離子為定性離子，豐度最大的作為定量離子，并優(yōu)化其碰撞能量。10種大環(huán)內(nèi)酯的優(yōu)化質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

不同的色譜柱對(duì)同一樣品有不同的保留時(shí)間。實(shí)驗(yàn)使用幾種不同的反相色譜柱進(jìn)行分離，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在現(xiàn)有的色譜洗脫條件下，Thermo Fisher公司的 Hypersil Gold C18柱(100 mm ×3.5 mm，5 μm)由于填料顆粒細(xì)，使峰形更加對(duì)稱尖銳，信噪比更高，因此本文最終選擇該色譜柱作為分離柱。在流動(dòng)相中加入適量的甲酸(0.1%)，可以提高靈敏度。在現(xiàn)有的色譜條件下進(jìn)行色譜分離，10種大環(huán)內(nèi)酯類分析物，除了林可霉素保留時(shí)間較小，其余9種大環(huán)內(nèi)酯藥物保留時(shí)間均在6～8 min內(nèi)，在2 min左右全部被洗脫下來(lái)，且大部分色譜峰重疊在一起，每個(gè)色譜峰的底寬約14 S，見(jiàn)圖1。為了使每一個(gè)色譜峰有足夠的掃描點(diǎn)(duty cycle)，優(yōu)化了質(zhì)譜參數(shù)。在1.2項(xiàng)的優(yōu)化條件下，每個(gè)子離子的掃描駐留時(shí)問(wèn)為5 ms，每個(gè)子離子切換時(shí)間為3 ms，每個(gè)分析物色譜掃描點(diǎn)在25個(gè)以上，保證每個(gè)色譜峰有良好的重現(xiàn)性。

2.3 方法的定性、定量、線性范圍、回收率和精密度 進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)，若樣品的色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品一致，并且在扣除背景后的待測(cè)物進(jìn)行監(jiān)測(cè)的全部特征離子的相對(duì)豐度應(yīng)與標(biāo)準(zhǔn)品一致，離子豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液偏差在規(guī)定范圍內(nèi)[11]，則可判斷樣品中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)物。采用不含大環(huán)內(nèi)酯類藥物的龍蝦、鮰魚(yú)為樣品基質(zhì)空白，制備 5、10、20、50、100、200 μg/kg 的 10 種抗生素樣品的混合標(biāo)準(zhǔn)系列標(biāo)準(zhǔn)液，進(jìn)樣測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值Y為縱坐標(biāo)，工作溶液的質(zhì)量濃度X(μg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，樣品溶液的響應(yīng)值均在儀器測(cè)定的線性范圍內(nèi)。在5～200 μg/kg范圍內(nèi)10種抗生素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性均為良好，線性相關(guān)系數(shù)R＞0.99。由下表可以發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)用于提取基質(zhì)中的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的方法，回收率穩(wěn)定在60% ～120%之間;日內(nèi)精密度小于11%，完全滿足日常分析檢驗(yàn)的需要。對(duì)陰性龍蝦和鮰魚(yú)進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)(5、20、50 μg/kg)，數(shù)據(jù)及計(jì)算結(jié)果如表3和表4所示。

圖1 空白龍蝦樣品中添加10種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的選擇離子色譜圖(加標(biāo)水平5 μg/kg)

表3 龍蝦加標(biāo)回收率和精密度

表4 鮰魚(yú)加標(biāo)回收率和精密度

3 結(jié)論

建立了HPLC-MS/MS同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中10種大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的檢測(cè)方法。采用乙腈做溶劑，超聲提取，進(jìn)一步有效去除基質(zhì)干擾，方法快速簡(jiǎn)潔，靈敏度、檢出限、精密度等指標(biāo)均滿足國(guó)內(nèi)外相關(guān)法規(guī)的要求，可為水產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留的監(jiān)督檢驗(yàn)和殘留監(jiān)控提供技術(shù)支持，適合大量進(jìn)出口水產(chǎn)品中大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢測(cè)。

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