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        人白細(xì)胞介素-15的高效表達(dá)

        2012-11-23 05:56:34許崇利惠遠(yuǎn)峰許崇波
        中國(guó)獸藥雜志 2012年4期
        關(guān)鍵詞:菌體質(zhì)粒菌株

        許崇利,惠遠(yuǎn)峰,謝 瑩,許崇波

        (1.吉林化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院,吉林吉林 132022;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,長(zhǎng)春 130062;3.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院,遼寧大連 116622)

        白細(xì)胞介素 -15(Interleukin-15,IL-15)是Grabstein[1]于1994年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子。與IL-2具有類似的生物活性。它能促進(jìn)T細(xì)胞,NK細(xì)胞和B細(xì)胞的增值和分化,誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ及 TNF-α的作用[2]。近年來(lái)的研究表明,IL-15在抗腫瘤、抗微生物感染和治療艾滋病等方面均有重要的作用[3-5]。人體多種組織和細(xì)胞均可表達(dá)IL-15,其中骨骼肌、胎盤、腎臟、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及脂多糖刺激的外周血單核細(xì)胞表達(dá)較豐富。另外,IL-15有其自身高親和力的特異性受體IL-15Rα,IL-15與其受體IL-15Rα的親和力是IL-2與IL-2 Rα的1000倍[2],將有可能代替IL-2成為抗感染、抗腫瘤強(qiáng)有力的生物制劑。而且天然IL-15產(chǎn)量低、不易大量制備,為此我們構(gòu)建了表達(dá)IL-15蛋白的基因工程菌株,實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá),并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究,從而為IL-15生物活性和生產(chǎn)工藝研究提供了可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 菌株 含IL-15基因的重組菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15),由吉林化工學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

        1.2 試劑 限制性核酸內(nèi)切酶(NcoI、EcoR I),標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量,購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒,購(gòu)自Promega公司。

        1.3 重組菌株的酶切鑒定 質(zhì)粒DNA的酶切鑒定按文獻(xiàn)[6]介紹的方法進(jìn)行。

        1.4 IL-15基因表達(dá)條件的優(yōu)化

        1.4.1 不同pH值培養(yǎng)基對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響 將LB液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為6.5、7.0、和7.5,然后分裝于200 mL錐形瓶中,每瓶50 mL,按1%的接種量接種重組菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15),于37℃ 160 r/min培養(yǎng),待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

        1.4.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響將LB液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至7.0,然后分裝于200 mL錐形瓶中,每瓶50 mL,按1%的接種量接種重組菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15),分別于35℃、37℃和39℃ 160 r/min培養(yǎng),待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

        1.4.3 不同菌體密度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響按1.4.2方法制備LB液體培養(yǎng)基和接種,于37℃160 r/min培養(yǎng),分別于菌體密度OD600達(dá)到0.4、0.6、0.8、1.0和1.2時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

        1.4.4 不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響 按1.4.2方法制備LB液體培養(yǎng)基和接種,于37℃ 160 r/min培養(yǎng),待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí),加入終濃度分別為 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 和1.5 mmol/L的IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)3 h后,進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

        1.4.5 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響按1.4.2方法制備LB液體培養(yǎng)基和接種,于37℃160 r/min培養(yǎng),待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí),加入終濃度為1.0 mmol/L 的 IPTG,分別于1、2、3、4、5 h取樣,進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

        2 結(jié)果

        2.1 IL-15基因的鑒定 首先用質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒pET28c(+)-IL-15,重組質(zhì)粒經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶NcoI/EcoR I酶切后,經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析,在約360 bp處有一條帶,與預(yù)期的IL-15基因片段相一致。同時(shí)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定,結(jié)果證實(shí)與GenBank報(bào)道的序列一致且閱讀框架正確,從而成功地構(gòu)建了含IL-15基因的表達(dá)質(zhì)粒pET28c(+)-IL-15(圖1)。

        圖1 重組質(zhì)粒pET28c(+)-IL-15的酶切電泳結(jié)果

        2.2 不同pH值培養(yǎng)基對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響不同pH值的培養(yǎng)基對(duì)IL-15蛋白表達(dá)水平有明顯影響,其中培養(yǎng)基pH值為7.0時(shí),IL-15蛋白表達(dá)量最高,且位于低分子量蛋白Marker 16 ku處,與預(yù)期的IL-15蛋白分子量相一致,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,IL-15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的27.2%(圖2)。

        圖2 不同pH值的培養(yǎng)基對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響

        2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響不同的培養(yǎng)溫度對(duì)IL-15蛋白表達(dá)量也有較大的影響,當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)IL-15蛋白表達(dá)量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,IL-15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量28.1%(圖3)。

        圖3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響

        2.4 不同菌體密度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響當(dāng)培養(yǎng)基的菌體密度OD600達(dá)到0.4時(shí),IL-15蛋白表達(dá)量開(kāi)始顯著增加,當(dāng)菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí),IL-15蛋白表達(dá)量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,IL-15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的28.6%(圖4)。

        圖4 不同菌體密度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響

        2.5 不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響 不同的IPTG濃度對(duì)IL-15蛋白表達(dá)量的影響不同,當(dāng)IPTG濃度達(dá)到1.0 mmol/L時(shí)IL-15蛋白表達(dá)量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,IL-15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的27.5%(圖5)。

        圖5 不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響

        2.6 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,IL-15蛋白表達(dá)量也逐步增加,當(dāng)IPTG誘導(dǎo)時(shí)間為3 h時(shí),融合蛋白表達(dá)量最高,利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析,IL-15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的30.3%(圖6)。

        圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響

        綜上所述,重組菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)優(yōu)化表達(dá)條件是:培養(yǎng)基pH值7.0、培養(yǎng)溫度37℃、IPTG誘導(dǎo)濃度1.0 mmol/L、菌體生長(zhǎng)密度OD600達(dá)到1.0時(shí)加入IPTG、誘導(dǎo)時(shí)間為3 h,此時(shí)表達(dá)效果較理想。

        3 討論

        IL-15是一個(gè)促炎性細(xì)胞因子,在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)已證實(shí)有多種組織表達(dá)IL-15受體。IL-15通過(guò)與其受體結(jié)合首先激活JAK1/3,進(jìn)而使 STAT3/5/6磷酸化誘導(dǎo)下游基因。IL-15可以激活src相關(guān)的酪氨酸激酶,誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá),激活Ras/Raf/MAPK途徑最終活化fos/jun[7],在某些細(xì)胞中還可以激活 NF- κB。IL-15通過(guò)其受體激活下游基因表達(dá),進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。研究表明IL-15參與許多疾病的發(fā)病,如自身免疫及炎癥性疾病、結(jié)節(jié)病、多發(fā)性骨髓瘤、免疫排斥等[8]。因此深入研究IL-15有利于闡明一些疾病發(fā)病機(jī)制、診斷及治療。

        研究從人外周血中克隆了IL-15基因,構(gòu)建了重組表達(dá)菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15),實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá)。外源基因的表達(dá)水平不僅涉及到宿主、載體和外源基因三者之間的關(guān)系,而且受到所處環(huán)境的影響[9]。對(duì)于各種影響因素的優(yōu)化組合,可以通過(guò)每次改變一個(gè)因素或者同時(shí)改變幾個(gè)參數(shù)來(lái)進(jìn)行[10]。本研究中,我們固定其它參數(shù),而對(duì)單個(gè)因素加以優(yōu)化,從而獲得整體的優(yōu)化[11]。

        通過(guò)改變參數(shù),從而找到最佳表達(dá)條件,其優(yōu)化表達(dá)條件是:培養(yǎng)基pH值7.0、培養(yǎng)溫度37℃、IPTG誘導(dǎo)濃度1.0 mmol/L、菌體生長(zhǎng)密度OD600達(dá)到1.0時(shí)加入IPTG、誘導(dǎo)時(shí)間為3h。從而為其生物活性和生產(chǎn)工藝研究提供了可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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        [4]Giron-Michel J,Azzi S,Khawam K,et al.Interleukin-15 is a major regulator of the cell-microenvi-ronment interactions in human renal cancer[J].Bull Cancer,2011,98(5):32-39.

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        [10]許崇利,許崇波,惠遠(yuǎn)峰,等.A型產(chǎn)氣莢膜梭菌重組菌株BL21(DE3)pXMCPA02表達(dá)條件優(yōu)化[J].中國(guó)獸藥雜志,2009,43(11):21-24.

        [11]許崇利,謝 瑩,許崇波,等.人γ干擾素的高效表達(dá)[J].中國(guó)獸藥雜志,2010,44(11):17-21.

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