許崇利，惠遠(yuǎn)峰，謝 瑩，許崇波

(1.吉林化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院，吉林吉林 132022;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062;3.大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧大連 116622)

白細(xì)胞介素 -15(Interleukin-15，IL-15)是Grabstein[1]于1994年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子。與IL-2具有類似的生物活性。它能促進(jìn)T細(xì)胞，NK細(xì)胞和B細(xì)胞的增值和分化，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ及 TNF-α的作用[2]。近年來(lái)的研究表明，IL-15在抗腫瘤、抗微生物感染和治療艾滋病等方面均有重要的作用[3-5]。人體多種組織和細(xì)胞均可表達(dá)IL-15，其中骨骼肌、胎盤、腎臟、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及脂多糖刺激的外周血單核細(xì)胞表達(dá)較豐富。另外，IL-15有其自身高親和力的特異性受體IL-15Rα，IL-15與其受體IL-15Rα的親和力是IL-2與IL-2 Rα的1000倍[2]，將有可能代替IL-2成為抗感染、抗腫瘤強(qiáng)有力的生物制劑。而且天然IL-15產(chǎn)量低、不易大量制備，為此我們構(gòu)建了表達(dá)IL-15蛋白的基因工程菌株，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，并對(duì)其表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，從而為IL-15生物活性和生產(chǎn)工藝研究提供了可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株 含IL-15基因的重組菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)，由吉林化工學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 試劑 限制性核酸內(nèi)切酶(NcoI、EcoR I)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量，購(gòu)自TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒，購(gòu)自Promega公司。

1.3 重組菌株的酶切鑒定 質(zhì)粒DNA的酶切鑒定按文獻(xiàn)[6]介紹的方法進(jìn)行。

1.4 IL-15基因表達(dá)條件的優(yōu)化

1.4.1 不同pH值培養(yǎng)基對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響 將LB液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)為6.5、7.0、和7.5，然后分裝于200 mL錐形瓶中，每瓶50 mL，按1%的接種量接種重組菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)，于37℃ 160 r/min培養(yǎng)，待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.4.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響將LB液體培養(yǎng)基的pH值調(diào)整至7.0，然后分裝于200 mL錐形瓶中，每瓶50 mL，按1%的接種量接種重組菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)，分別于35℃、37℃和39℃ 160 r/min培養(yǎng)，待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.4.3 不同菌體密度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響按1.4.2方法制備LB液體培養(yǎng)基和接種，于37℃160 r/min培養(yǎng)，分別于菌體密度OD600達(dá)到0.4、0.6、0.8、1.0和1.2時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.4.4 不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響 按1.4.2方法制備LB液體培養(yǎng)基和接種，于37℃ 160 r/min培養(yǎng)，待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí)，加入終濃度分別為 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 和1.5 mmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

1.4.5 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響按1.4.2方法制備LB液體培養(yǎng)基和接種，于37℃160 r/min培養(yǎng)，待菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol/L 的 IPTG，分別于1、2、3、4、5 h取樣，進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 IL-15基因的鑒定 首先用質(zhì)粒試劑盒提取重組質(zhì)粒pET28c(+)-IL-15，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶NcoI/EcoR I酶切后，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約360 bp處有一條帶，與預(yù)期的IL-15基因片段相一致。同時(shí)對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測(cè)定，結(jié)果證實(shí)與GenBank報(bào)道的序列一致且閱讀框架正確，從而成功地構(gòu)建了含IL-15基因的表達(dá)質(zhì)粒pET28c(+)-IL-15(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pET28c(+)-IL-15的酶切電泳結(jié)果

2.2 不同pH值培養(yǎng)基對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響不同pH值的培養(yǎng)基對(duì)IL-15蛋白表達(dá)水平有明顯影響，其中培養(yǎng)基pH值為7.0時(shí)，IL-15蛋白表達(dá)量最高，且位于低分子量蛋白Marker 16 ku處，與預(yù)期的IL-15蛋白分子量相一致，利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析，IL-15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的27.2%(圖2)。

圖2 不同pH值的培養(yǎng)基對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響

2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響不同的培養(yǎng)溫度對(duì)IL-15蛋白表達(dá)量也有較大的影響，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)IL-15蛋白表達(dá)量最高，利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析，IL-15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量28.1%(圖3)。

圖3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響

2.4 不同菌體密度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響當(dāng)培養(yǎng)基的菌體密度OD600達(dá)到0.4時(shí)，IL-15蛋白表達(dá)量開(kāi)始顯著增加，當(dāng)菌體密度OD600達(dá)到1.0時(shí)，IL-15蛋白表達(dá)量最高，利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析，IL-15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的28.6%(圖4)。

圖4 不同菌體密度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響

2.5 不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響 不同的IPTG濃度對(duì)IL-15蛋白表達(dá)量的影響不同，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到1.0 mmol/L時(shí)IL-15蛋白表達(dá)量最高，利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析，IL-15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的27.5%(圖5)。

圖5 不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響

2.6 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，IL-15蛋白表達(dá)量也逐步增加，當(dāng)IPTG誘導(dǎo)時(shí)間為3 h時(shí)，融合蛋白表達(dá)量最高，利用GDS-8000凝膠成像分析系統(tǒng)軟件分析，IL-15蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對(duì)含量的30.3%(圖6)。

圖6 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)IL-15基因表達(dá)的影響

綜上所述，重組菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)優(yōu)化表達(dá)條件是:培養(yǎng)基pH值7.0、培養(yǎng)溫度37℃、IPTG誘導(dǎo)濃度1.0 mmol/L、菌體生長(zhǎng)密度OD600達(dá)到1.0時(shí)加入IPTG、誘導(dǎo)時(shí)間為3 h，此時(shí)表達(dá)效果較理想。

3 討論

IL-15是一個(gè)促炎性細(xì)胞因子，在天然免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)已證實(shí)有多種組織表達(dá)IL-15受體。IL-15通過(guò)與其受體結(jié)合首先激活JAK1/3，進(jìn)而使 STAT3/5/6磷酸化誘導(dǎo)下游基因。IL-15可以激活src相關(guān)的酪氨酸激酶，誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)，激活Ras/Raf/MAPK途徑最終活化fos/jun[7]，在某些細(xì)胞中還可以激活 NF- κB。IL-15通過(guò)其受體激活下游基因表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。研究表明IL-15參與許多疾病的發(fā)病，如自身免疫及炎癥性疾病、結(jié)節(jié)病、多發(fā)性骨髓瘤、免疫排斥等[8]。因此深入研究IL-15有利于闡明一些疾病發(fā)病機(jī)制、診斷及治療。

研究從人外周血中克隆了IL-15基因，構(gòu)建了重組表達(dá)菌株BL21(DE3)(pET28c(+)-IL-15)，實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的高效表達(dá)。外源基因的表達(dá)水平不僅涉及到宿主、載體和外源基因三者之間的關(guān)系，而且受到所處環(huán)境的影響[9]。對(duì)于各種影響因素的優(yōu)化組合，可以通過(guò)每次改變一個(gè)因素或者同時(shí)改變幾個(gè)參數(shù)來(lái)進(jìn)行[10]。本研究中，我們固定其它參數(shù)，而對(duì)單個(gè)因素加以優(yōu)化，從而獲得整體的優(yōu)化[11]。

通過(guò)改變參數(shù)，從而找到最佳表達(dá)條件，其優(yōu)化表達(dá)條件是:培養(yǎng)基pH值7.0、培養(yǎng)溫度37℃、IPTG誘導(dǎo)濃度1.0 mmol/L、菌體生長(zhǎng)密度OD600達(dá)到1.0時(shí)加入IPTG、誘導(dǎo)時(shí)間為3h。從而為其生物活性和生產(chǎn)工藝研究提供了可靠的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

[1]Grabstein K H，Eisenman J，shaneborok K，et al.Cloning of a novel T cell growth factor which interacts with the β chain of the IL-2 recepeor[J].Science，1994，26(4):965.

[2]Eisenman J，Ahdieh M，Beers C，et al.Inerleukin-15 interactions with inerleukin-15 receptor complexs:charact-erization and species specificity[J].Cytokine，2002，20(3):121-129.

[3]Jakobisiak M，Golab J，Lasek W.Interleukin 15 as a promising candidate for tumor immunotherapy[J].Cytokine Growth Factor Rev，2011，22(2):99-108.

[4]Giron-Michel J，Azzi S，Khawam K，et al.Interleukin-15 is a major regulator of the cell-microenvi-ronment interactions in human renal cancer[J].Bull Cancer，2011，98(5):32-39.

[5]Matsumoto K，Kikuchi E，Horinaga M，et al.Intravesical interleukin-15 gene therapy in an orthotopic bladder cancer model[J].Hum Gene Ther，2011，22(11):1423-1432.

[6]Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T.Molecular Cloning[M].2nd Ed，New York:Cold Spring Harbor Labora-tory Press，1989:1-50.

[7]Torelli G F，Guarini A，Maggio R，et al.Expansion of natural killer cells with lytic activity against autologous blasts from adult and pediatric acute lymphoid leukemia patients in complete hematologic remission[J].Haem atologica，2005，90(6):785-792.

[8]McInnes I B，Gracie J A，Harnett M，et al.New strategies to control inflammatory synovitis:interleukin 15 and beyond[J].Ann Rheum Dis，2003，62(Suppl 2):51-54.

[9]饒桂榮，陳文吟，栗寬源，等.重組人抗HBsAg單鏈抗體的中試發(fā)酵工藝研究[J].中國(guó)生化藥物雜志，2005，26(3):141-143.

[10]許崇利，許崇波，惠遠(yuǎn)峰，等.A型產(chǎn)氣莢膜梭菌重組菌株BL21(DE3)pXMCPA02表達(dá)條件優(yōu)化[J].中國(guó)獸藥雜志，2009，43(11):21-24.

[11]許崇利，謝 瑩，許崇波，等.人γ干擾素的高效表達(dá)[J].中國(guó)獸藥雜志，2010，44(11):17-21.