裴凌鵬 白 巖 惠伯棣

(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

蝦青素對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞氧化損傷及炎性的影響

裴凌鵬 白 巖 惠伯棣1

(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

目的 研究蝦青素對骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞氧化損傷及炎性的逆轉(zhuǎn)作用。方法 選擇15只5月齡新西蘭兔，采用內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶切斷并切除內(nèi)側(cè)半月板的OA動(dòng)物模型制作方法，體外分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。以假手術(shù)組細(xì)胞為正常對照組，造模組細(xì)胞為OA軟骨細(xì)胞，分別加入10、20、30 μg/ml蝦青素(低、中、高劑量);從第9周開始，每周處死1組動(dòng)物，分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。連續(xù)8 w，DCFH-DA法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，Griess法測定培養(yǎng)上清中氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量，RT-PCR法檢測各組細(xì)胞相關(guān)炎性因子(IL)-1β、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p53基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果 DCFH-DA法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平，對照組與模型組差異顯著(P＜0.01);蝦青素低、中、高劑量組與模型組差異顯著(P＜0.01)。模型組中NaNO2、SOD、GSH-Px與對照組差異顯著(P＜0.01);NaNO2、SOD、GSH-Px水平蝦青素低、中、高劑量組與模型組差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)。模型組中IL-1β、iNOS、p53基因mRNA的表達(dá)量與對照組及各劑量蝦青素組差異顯著(P＜0.01)。結(jié)論 蝦青素對OA軟骨細(xì)胞的氧化損傷及炎性有逆轉(zhuǎn)作用，具有研發(fā)成為OA治療藥物的潛能。

蝦青素;骨關(guān)節(jié)炎;軟骨細(xì)胞;氧化損傷;炎性因子

骨關(guān)節(jié)炎(OA)表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨完整性受損，軟骨下骨板及關(guān)節(jié)邊緣骨病變，即關(guān)節(jié)軟骨的退變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生。蝦青素(Astaxanthin)，全稱為 3，3-二羥基-β 胡蘿卜素-4，4-酮，是一種含氧的類胡蘿卜素，其分子結(jié)構(gòu)的碳骨架由中央多聚烯鏈和位于兩側(cè)的芳香環(huán)組成，并在每個(gè)芳香環(huán)上各有一個(gè)酮基(=O)和一個(gè)羥基(-OH)。由于其有極強(qiáng)的抗氧化能力，具有抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力、抗癌、抗骨質(zhì)疏松等多種生物學(xué)活性〔1〕。本實(shí)驗(yàn)旨在研究蝦青素對OA軟骨抗氧化損傷及抗炎的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15只5月齡新西蘭兔，體重(300±25)g，雌雄各半，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號：JXYX-D20110720)?；钚匝?ROS)檢測試劑盒、一氧化氮檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱這氧化物酶(GSHPx)檢測試劑盒均為南京建成生物工程公司產(chǎn)品;白介素(IL)-β、腫瘤壞死因子(TNF)-α放免試劑盒為解放軍總醫(yī)院放免所產(chǎn)品;低熔點(diǎn)瓊脂為Sigma公司產(chǎn)品;總RNA提取試劑RNAisoTMPlus、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Reagent Kit和 PCR試劑盒TaKaRa TapTM購自寶生物工程(大連)有限公司;蝦青素(純度≥95%)由中央民族大學(xué)國家民委-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥化室提供。

1.2 動(dòng)物分組及動(dòng)物模型建立

分為正常對照組、模型組、蝦青素低劑量組、蝦青素中劑量組、蝦青素高劑量組，每組3只。兔OA動(dòng)物模型的建立采用內(nèi)側(cè)副韌帶、前后交叉韌帶切斷并切除內(nèi)側(cè)半月板改良 Hulth法〔2〕。造模組動(dòng)物用水合氯醛(10%，1 ml/kg)麻醉，仰臥位，四肢固定于自制手術(shù)臺上，脫毛，碘伏消毒，鋪無菌洞巾，取雙后膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)橫向切口約1.5 cm，逐層打開關(guān)節(jié)腔，切斷內(nèi)側(cè)副韌帶，探查關(guān)節(jié)腔無原發(fā)病變后，切斷前交叉韌帶，全部切除內(nèi)側(cè)半月板造模，逐層縫合切口。假手術(shù)組動(dòng)物操作同前，但不切斷前交叉韌帶和內(nèi)側(cè)半月板。術(shù)后每天肌注青霉素20萬 U，共1 w，預(yù)防感染。術(shù)后采用一籠一兔喂養(yǎng)，造模1 w后每日驅(qū)趕兔子來回行走約0.5 h。每周制作一組模型，連續(xù)8 w。從第9周開始，每周處死一組動(dòng)物，分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，測定相關(guān)指標(biāo)，連續(xù)8 w。正常對照組由假手術(shù)動(dòng)物分離獲得，10%IMDM培養(yǎng)液培養(yǎng);OA模型分4組，由造模動(dòng)物分離獲得，模型組10%IMDM正常培養(yǎng);蝦青素低劑量組加入10 μg/ml蝦青素，中劑量組加入20 μg/ml蝦青素，高劑量組加入30 μg/ml蝦青素。蝦青素用含10%血清IMDM 培養(yǎng)基配制成1 mg/ml的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾無菌后，逐漸稀釋得到30、20、10 μg/ml的藥液。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 軟骨細(xì)胞提取與培養(yǎng) 將新西蘭兔固定，空氣栓塞處死，剝皮暴露膝關(guān)節(jié)。截取膝關(guān)節(jié)，粗略修剪后浸入無菌DHank液體中，帶入超凈工作臺，手術(shù)刀片取關(guān)節(jié)表面軟骨，放入10 ml無菌玻璃平皿，倒入D-Hank液掩蓋標(biāo)本。軟骨切碎約為1 mm×1 mm的小塊，D-Hank漂洗軟骨小塊3次，放入至10 cm×10 cm IMDM培養(yǎng)液瓶中。移入離心筒中，1 400 r/min離心5 min。收集全部切碎軟骨，加入0.25%胰酶(含0.04%EDTA)，37℃消化30 min。吸出胰酶，加入4 ml 0.2%Ⅱ型膠原酶，置CO2培養(yǎng)箱中37℃消化4 h，每0.5 h取出振搖3 min。收集上清液，1 400 r/min離心10 min，棄上清，懸浮細(xì)胞于16 ml IMDM培養(yǎng)液中，200目過濾至一新無菌離心管中。5×104接種于培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。

1.3.2 軟骨細(xì)胞中ROS的測定 按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA，終濃度為10 μmol/L。細(xì)胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，控制細(xì)胞濃度在(1～20)×106/ml，37℃，20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸。無血清培養(yǎng)液洗3次，充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFHDA。PBS重懸，流式細(xì)胞儀488 nm光激發(fā)，檢測525 nm發(fā)射光強(qiáng)度，計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，以檢測細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度反映ROS水平。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO、SOD和GSH-Px含量的測定 分離獲取軟骨細(xì)胞并分組，按5×104/ml，每孔0.5 ml接種于24孔板，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)60 h待細(xì)胞貼壁后，依據(jù)分組更換正常培養(yǎng)液或含不同濃度AHF的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，5 000 r/min，離心10 min，取上清-20℃凍存待測。NO檢測：鑒于NO性質(zhì)極不穩(wěn)定，在體內(nèi)、體外均能很快生成亞硝酸鹽和硝酸鹽，因此測定標(biāo)本中亞硝酸鹽和硝酸鹽濃度可以作為衡量NO水平的指標(biāo)。檢測采用經(jīng)典Griess法，操作按照說明書進(jìn)行。SOD和GSH-Px檢測按照說明書進(jìn)行。

1.3.4 細(xì)胞相關(guān)炎性因子表達(dá)的檢測 細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，提取各組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增各目的基因，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。引物序列如下：p53(444 bp)上游：5'-ACAGAAACACCTTCCGACAC-3'，下游：5'-CCTGGGCATCCTTTAGCT-3';IL-1β(474 bp)上游：5'-TGCTGTCCAGACGAGGGCAT-3'，下 游：5'-ACTCTCCAGCTGCAGGGTAG-3';iNOS(465 bp) 上游：5'-CATGAAGTACATGCAGAGCG-3'，下游：5'-GCAAGGCGCAGCTGAACAAG-3';GAPDH(618 bp)上游：5'-GAGCCAAAAGGGTCATCATC-3'，下 游：5'-TGTGGCCAAATTCGTTGTCA-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞中ROS水平的變化

與對照組比較，模型組ROS水平明顯升高(P＜0.01)，說明OA軟骨細(xì)胞中確實(shí)存在氧化損傷。與模型組比較，蝦青素低、中、高劑量組可使ROS水平顯著降低(P＜0.01);說明加入不同劑量的蝦青素后，降低了OA軟骨細(xì)胞中ROS的水平。見表1。

2.2 軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO、SOD和GSH-Px水平變化

與對照組相比，模型組NaNO2含量明顯升高(P＜0.01)，而SOD活性、GSH-Px活性明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較，蝦青素低、中、高劑量組可顯著降低NaNO2含量，顯著升高SOD活性、GSH-Px活性(均P＜0.01)。見表1。

2.3 軟骨細(xì)胞相關(guān)炎性因子表達(dá)的影響

與對照組相比，模型組IL-1β、iNOS和 p53基因 mRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，蝦青素低、中、高劑量組可顯著升高IL-1β、iNOS和p53基因mRNA的表達(dá)量(P＜0.01)。見表2。

表1 軟骨細(xì)胞中ROS、NO、SOD和GSH-Px水平的變化(n=6s)

表1 軟骨細(xì)胞中ROS、NO、SOD和GSH-Px水平的變化(n=6s)

與對照組比較：1)P＜0.01;與模型組比較：2)P＜0.01;下表同

組別 ROS NaNO2(μmol/L) SOD(U/ml) GSH-Px(U)對照組6.02±0.51 5.63±0.40 52.11±5.08 79.90±6.01模型組 12.31±1.371) 9.89±0.621) 30.08±3.311) 56.15±4.881)蝦青素低劑量組 10.21±1.222) 8.26±0.602) 39.12±3.222) 64.28±4.802)蝦青素中劑量組 9.26±1.102) 7.89±0.562) 46.03±3.622) 70.11±5.322)蝦青素高劑量組 8.17±0.732) 7.10±0.542) 48.74±3.702) 74.52±5.402)

表2 軟骨細(xì)胞相關(guān)炎性因子IL-1β、iNOS和p53基因mRNA表達(dá)變化(n=6±s)

表2 軟骨細(xì)胞相關(guān)炎性因子IL-1β、iNOS和p53基因mRNA表達(dá)變化(n=6±s)

組別 IL-1β/GAPDH iNOS/GAPDH p53/GAPDH對照組8.12±0.66 23.52±2.11 30.17±2.50模型組 12.37±1.131) 36.83±3.291) 49.69±2.801)蝦青素低劑量組 10.79±1.102) 30.26±3.002) 42.19±2.802)蝦青素中劑量組 10.10±0.922) 27.46±2.782) 40.06±2.522)蝦青素高劑量組 9.33±0.722) 25.89±2.592) 38.36±2.372)

3 討論

所謂ROS，是指機(jī)體內(nèi)或者自然環(huán)境中由氧組成、含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)總稱，主要有一種激發(fā)態(tài)的氧分子，即重態(tài)氧分子或稱單線態(tài)氧分子。常見的兩種含氧的自由基分別為超氧陰離子自由基、羥自由基;三種過氧化物，分別為過氧化氫和過氧化脂質(zhì)以及一種含氮的氧化物。ROS以其高反應(yīng)性在生命活動(dòng)中扮演了重要的角色，是近年來軟骨細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)〔3〕。本研究說明OA軟骨細(xì)胞存在著氧化損傷。蝦青素對OA的治療作用可能是通過抗氧化損傷機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。

IL-1β表達(dá)增高對軟骨損傷和退化具有重要作用，其能通過蛋白激酶MAPK激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)等信號通路，刺激MMP-1大量表達(dá)，引起軟骨更為強(qiáng)烈的吸收〔4〕。發(fā)生OA的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞iNOS表達(dá)增高。iNOS催化精氨酸與氧分子的反應(yīng)，形成一氧化氮，與抑制軟骨細(xì)胞蛋白聚糖合成和誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡過程有關(guān)〔5〕。OA病變的軟骨組織出現(xiàn)凋亡細(xì)胞明顯增加，且與OA病情分級呈正相關(guān)〔6〕。p53是一種重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劑量為10～30 μg/ml的蝦青素能抑制軟骨細(xì)胞IL-1β、iNOS、p53的表達(dá)，大大降低炎性反應(yīng)的發(fā)生，延緩細(xì)胞凋亡進(jìn)程。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)蝦青素對OA軟骨細(xì)胞具有一定的生長調(diào)節(jié)作用，可有效降低軟骨細(xì)胞因氧化而造成的損傷，減緩細(xì)胞凋亡速度，提高細(xì)胞抗炎能力，從而達(dá)到治療OA的目的，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

1 惠伯棣，裴凌鵬.類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)〔M〕.北京：中國輕工業(yè)出版社，2005：317-22.

2 劉獻(xiàn)祥，李 西，周江濤.改良Hulth造模法復(fù)制膝骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005;25(12)：1104-8.

3 Le Bras M，Clement MV，Pervaiz S，et al.Reactive oxygen species and the mitochondrial signaling path way of cell death〔J〕.Histopathol，2005;20(1)：205-19.

4 Aigner T，Soeder S，Haag J.IL-1beta and BMPs-interactive players of cartilage matrix degradation and regeneration〔J〕.Eur Cell Mater，2006;12：49-56.

5 Schmidt N，Pautz A，Art J，et al.Transcriptional and post-transcriptional regulation of iNOS expression in human chondrocytes〔J〕.Biochem Pharmacol，2010;79(5)：722-32.

6 Kim HT，Teng MS，Dang AC.Chondrocyte apoptosis：implications for osteochondral allograft transplantation〔J〕.Clin Orthop Relat Res，2008;466(8)：1819-25.

Study of Astaxanthin on anti-oxidative damage and anti-inflammatory of osteoarthritis cartilage cells

PEI Ling-Peng，BAI Yan，HUI Bo-Di.
MINZU University of China，State Nationalities Affairs Commission and Department of Educational Key Lab of Minority Traditional Medicine，Beijing 100081，China

Objective Objective：To study the reverse effect of the oxidative damage and inflammatory on cartilage cells by Astaxanthin.Methods Fifteen New Zealand white rabbits of 5 month old were selected.Osteoarthritis cartilage cells in model groups were added Astaxanthin 10，20，30 μg/ml respectively.A group of animals were sacrificed every week from the ninth weeks and the cartel age cells were isolated and cultured.For 8 w，the level of reactive oxygen species(ROS)in chondrocyte was detected by DCFH-DA，the content of NO and the activity of SOD and GSH-Px in cell culture supernatant were detected by Griess method.The related expression contents of IL-1β/GAPDH，iNOS/GAPDH and p53/GAPDH were detected by RT-PCR.Results DCFH-DA detection of intracellular reactive oxygen species in control group was less than that in model group and that in Astaxanthin groups was less than that in model group(P＜0.01).The contents of NaNO2，SOD and GSH-Px in osteoarthritis model group had significant differences with those of control group(P ＜0.01);and those in Astaxanthin groups had significant differences with those of control group(P＜0.01).The related expression contents of IL-1β/GAPDH，iNOS/GAPDH，p53/GAPDH in Astaxanthin groups were significant with model group.Conclusions Astaxanthin has anti-oxidative damage and anti-inflammatory effect of osteoarthritis cartilage cells within a certain dose range.It might be the main mechanism for astaxanthin to treat osteoarthritis.

Astaxanthin;Osteoarthritis;Chondrocytes;Oxidative damage;Inflammatory factor

R68

A

1005-9202(2012)23-5182-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.037

國家自然科學(xué)基金資助(No.30902011);教育部“中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金”資助(No.0910KYCZ01);教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃”資助(IRT0871)

1 北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院

裴凌鵬(1976-)，男，博士，副研究員，主要從事民族醫(yī)藥與膳食營養(yǎng)研究。

〔2011-10-24收稿 2012-01-15修回〕

(編輯 張永貴/胡國義)