楊小敏 楊剛毅 李 伶 胡文靜 葉 菲

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床生化教研室 教育部實(shí)驗(yàn)診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

小鼠FGF-21 siRNA腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定

楊小敏 楊剛毅1李 伶 胡文靜1葉 菲1

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床生化教研室 教育部實(shí)驗(yàn)診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

目的 構(gòu)建含F(xiàn)GF-21 siRNA基因的重組腺病毒載體并鑒定。方法 首先用BamHⅠ+HindⅢ雙酶切本課題組前期構(gòu)建的質(zhì)粒pSilencer1.0-shFGF-21，得到0.3 bp的目的片段，并將目的片段亞克隆入穿梭質(zhì)粒(pShuttle-shFGF-21，)，用I-CeuI和I-SceI雙酶切處理pAdxsi組腺病載體及pShuttle-shFGF-21，連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選、鑒定、測(cè)序后，最后在293細(xì)胞內(nèi)包裝擴(kuò)增為重組腺病毒。結(jié)果 設(shè)計(jì)并構(gòu)建了小鼠FGF-21基因特異性siRNA腺病毒載體，并經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定?？瞻咝纬蓪?shí)驗(yàn)測(cè)得腺病毒滴度為1×1010PFU/ml。結(jié)論 成功構(gòu)建了小鼠FGF-21基因特異性siRNA腺病毒載體。

RNA干擾;腺病毒載體;FGF-21;脂聯(lián)素

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21(FGF-21)是一種主要來(lái)源于肝臟和脂肪組織的細(xì)胞因子，肝、脂肪及胰腺是其主要外周靶組織。FGF-21具有降低肥胖和糖尿病動(dòng)物血糖、胰島素和血脂水平，保護(hù)胰島β細(xì)胞，調(diào)節(jié)糖脂代謝等功能。在肝臟中，F(xiàn)GF-21促進(jìn)游離脂肪酸(FFA)氧化并生成酮體。而在脂肪細(xì)胞中，F(xiàn)GF-21 刺激脂肪細(xì)胞分解，生成甘油三酯(TG)〔1，2〕。因此，F(xiàn)GF-21是繼瘦素和脂聯(lián)素發(fā)現(xiàn)之后又一個(gè)與胰島素抵抗(IR)有關(guān)的細(xì)胞因子。目前的研究結(jié)果尚不能完全闡明FGF-21的確切作用機(jī)制。為此，我們構(gòu)建了小鼠FGF-21 siRNA重組腺病毒載體，旨在為進(jìn)一步研究其生理功能構(gòu)建一個(gè)分子生物學(xué)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

攜帶脂聯(lián)素siRNA的質(zhì)粒pSilencer1.0-shFGF-21和RNA干擾陰性對(duì)照質(zhì)粒 pSilencer1.0-shGFP由本課題組前期構(gòu)建〔3〕。穿梭質(zhì)粒pShuttle和pAdxsi腺病毒載體系統(tǒng)由諾賽基因公司提供。限制性?xún)?nèi)切酶(NEB公司);T4 DNA連接酶(晶美生物公司);CIP酶(promega公司);dNTPs(上海生工);DNA Marker DL2000(大連寶生物公司);質(zhì)粒抽提純化試劑盒、膠回收試劑盒(威格拉斯生物技術(shù)公司);DMEM(Hyclone公司);Lipofectamine 2000(美國(guó)Gibco公司);DH5α、HEK293細(xì)胞為本課題組留存;胎牛血清、胰酶(Hyclone公司)?？敲顾?、酶解酪蛋白、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、胰島素、地塞米松(DEX)(Sigma公司);序列分析(上海鼎安生物科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 FGF-21-siRNA穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 用BamHⅠ/HindⅢ酶切pSilencer1.0-shFGF-21和pSilencer1.0-shGFP以及穿梭質(zhì)粒 pShuttle，膠回收 shFGF-21 cDNA(0.3 kb)和 pShuttle(4.2 kb)片段，用T4 DNA連接酶22℃連接4h，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LB卡那霉素抗性平板篩選陽(yáng)性菌落后，小量抽提質(zhì)粒，酶切并測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，得到的重組子命名為pShuttleshFGF-21和 pShuttle-GFP。

1.2.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建 用I-CeuⅠ和I-SceⅠ雙酶切處理pAdxsi載體及穿梭質(zhì)粒(pShuttle-shFGF-21和 pShuttle-GFP)，回收載體及含目的基因片段，用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布到氨芐抗性固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取若干陽(yáng)性菌落，接種到氨芐抗性液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，小量抽提質(zhì)粒，酶切并測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆，得到的重組子命名為pAd-shFGF-21和pAd-GFP。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液加入LB卡那霉素抗性培養(yǎng)基中，37℃ 300 r/min震蕩搖菌過(guò)夜，大量提取質(zhì)粒，并用PacⅠ酶切腺病毒質(zhì)粒使其線(xiàn)性化。

1.2.3 重組腺病毒的包裝、擴(kuò)增及滴度測(cè)定 用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，按5×105/孔接種于無(wú)菌六孔板中，5%CO2，37℃飽和濕度條件下培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染當(dāng)天換用新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至底面積的80% ～90%時(shí)，取用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。2～3 d出現(xiàn)細(xì)胞病變反應(yīng)(CPE)后，收集病毒。腺病毒滴度測(cè)定采用空斑形成實(shí)驗(yàn)：將HEK293細(xì)胞接種于96孔板上，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合時(shí)，加入不同倍數(shù)稀釋的病毒上清100 μl，50 ml/L CO2，37℃ 飽和濕度條件下培養(yǎng) 10 d后，加入中性紅溶液，37℃培養(yǎng)2 h后統(tǒng)計(jì)空斑數(shù)量，根據(jù)病毒滴度=空斑數(shù)量/稀釋因子×病毒稀釋液體積，計(jì)算病毒滴度。

2 結(jié)果

2.1 FGF-21-siRNA穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

pShuttle-shFGF-21和pShuttle-GFP質(zhì)粒DNA經(jīng)BamHⅠ/HindⅢ酶切后，得到酶切條帶為0.3 kb和4.2 kb的兩個(gè)片段，分別代表pShuttle質(zhì)粒和插入目的片斷，與預(yù)期結(jié)果一致，說(shuō)明FGF-21-siRNA表達(dá)框已正確地克隆到pShuttle載體上(圖1)。DNA序列分析也進(jìn)一步證實(shí)了FGF-21-siRNA表達(dá)框的正確插入。

2.2 重組腺病毒載體的構(gòu)建

重組腺病毒質(zhì)粒DNA(pAdshFGF-21和pAd-GFP)經(jīng)XhoI酶切后，得到6個(gè)片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。

圖1 穿梭質(zhì)粒pShuttle-shFGF-21和pShuttle-GFP酶切鑒定

圖2 重組腺病毒載體pAd-shFGF-21和pAd-GFP的酶切鑒定

2.3 重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增及滴度測(cè)定

HEK293細(xì)胞經(jīng)腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2 d后，即出現(xiàn)細(xì)胞變大變圓，折光性增強(qiáng)，出現(xiàn)串珠樣改變，并從細(xì)胞培養(yǎng)板上脫落。正常HEK293細(xì)胞未見(jiàn)上述變化(圖3)?？瞻咝纬蓪?shí)驗(yàn)測(cè)得腺病毒滴度為1×1010PFU/ml。

圖3 腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的細(xì)胞病變(CPE)

3 討論

人類(lèi)在后基因組時(shí)代面臨的主要挑戰(zhàn)是解讀大量編碼基因的功能并研究基因調(diào)控的分子機(jī)制?；虼虬泻突蛱蕹夹g(shù)被公認(rèn)為是研究基因功能和作用機(jī)制的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，它也存在著一些不足之處，如動(dòng)物模型建立周期長(zhǎng)，技術(shù)難度高且耗資巨大。同時(shí)，不能實(shí)現(xiàn)定時(shí)、定位的基因表達(dá)變化，并存在胚胎性致死和不育的可能等。這種缺陷對(duì)研究2型糖尿病(T2DM)、心血管疾病等后天性疾病極為不利。RNAi技術(shù)是分子生物學(xué)中繼單克隆抗體技術(shù)、基因重組和基因剔除等重大發(fā)明之后，新發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)高科技手段。作為新興的基因阻斷技術(shù)，RNAi已成為后基因組時(shí)代研究基因功能和疾病的分子生物學(xué)機(jī)制，以及基因治療的最直接和最有效的方法。它不同于傳統(tǒng)的在DNA水平的基因敲除，而是通過(guò)RNA干涉，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默，即在mRNA水平達(dá)到基因敲除的效果。因此，在基因功能研究上有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如整個(gè)流程設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，且作用迅速，效果明顯，使大量基因功能可以快速經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行檢測(cè)，并能實(shí)現(xiàn)基因的定時(shí)表達(dá)缺陷〔4，5〕，這對(duì)于研究有遺傳和環(huán)境因素共同參與疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

在前期研究中，根據(jù) siRNAs的設(shè)計(jì)原則〔6，7〕，我們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)編碼小鼠FGF-21基因的特異性siRNA寡核苷酸插入片段，利用pSilencer1.0-U6載體構(gòu)建了3個(gè)相應(yīng)的表達(dá)質(zhì)粒，將上述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入誘導(dǎo)分化后的3T3-L1脂肪細(xì)胞，篩選出一條抑制FGF-21表達(dá)最有效siRNA寡核苷酸片段，將其質(zhì)粒載體命名為pSilencer1.0-shFGF-21〔3〕。在此基礎(chǔ)上，本研究用BamHⅠ/HindⅢ雙酶切上述質(zhì)粒，將其亞克隆入穿梭質(zhì)粒pShuttle，用I-CeuI和I-SceI酶切線(xiàn)性化穿梭質(zhì)粒，并與骨架質(zhì)粒pAdxsi載體同源重組，最后在HEK293細(xì)胞內(nèi)包裝為重組腺病毒。

本研究所用pAdxsi腺病毒載體系統(tǒng)是目前基因治療中應(yīng)用最廣泛的一種載體系統(tǒng)之一，具有許多優(yōu)點(diǎn)，如轉(zhuǎn)染效率高，感染的宿主范圍廣，可以有效地轉(zhuǎn)染分裂和靜止期細(xì)胞，載體容量大，插入外源基因片段長(zhǎng)，目的基因的蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)水平較高，而且攜帶基因不整合到宿主細(xì)胞基因組中，對(duì)機(jī)體的安全性較高〔8〕。本研究中，我們先將腺病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，再將獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)菌制成感受態(tài)細(xì)胞，作為重組穿梭質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主菌，大大提高了同源重組的效率，在空斑形成實(shí)驗(yàn)中測(cè)定到了較高的病毒滴度。本研究中酶切、電泳圖譜和測(cè)序分析表明重組腺病毒質(zhì)粒DNA(pAd-shFGF-21)的構(gòu)建是成功的。

FGF-21是新近發(fā)現(xiàn)的與胰島素抵抗和T2DM具有重要關(guān)聯(lián)的細(xì)胞因子。盡管已有FGF-21基因剔除小鼠的文獻(xiàn)報(bào)道，但這種基因表達(dá)“全和無(wú)”式的模式，并不能真實(shí)反映人類(lèi)胰島素抵抗和T2DM的特征。人類(lèi)胰島素抵抗和T2DM是后天性疾病，基因缺陷表現(xiàn)為低水平的表達(dá)而非無(wú)表達(dá)。因此，利用RNAi技術(shù)產(chǎn)生的基因表達(dá)的部分抑制更有利于展現(xiàn)人類(lèi)胰島素抵抗和T2DM的病理生理特征。本研究構(gòu)建的重組腺病毒載體pAd-shFGF-21為在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，在體內(nèi)研究FGF-21的生理功能提供了一個(gè)重要的分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)。

1 Badman MK，Pissios P，Kennedy AR，et al.Hepatic fibroblast growth factor 21 is regulated by PPARalpha and is a key mediator of hepatic lipid metabolism in ketotic states〔J〕.Cell Metab，2007;5(6)：426-37.

2 Sun XG，Song G，Liu JH，et al.Construction of plasmid vector with Tat and its ability to transducer fusion protein into cells〔J〕.Chin J Biochem Mol Biol，2003;19(3)：354-8.

3 李 鈳，李 伶，楊剛毅.成千維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21調(diào)控小鼠肝臟和脂肪細(xì)胞的糖脂代謝〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2010;26(8)：699-702.

4 Yin JQ，Wan Y.RNA-mediated gene regulation system：now and the future〔J〕.Int J Mol Med，2002;10(4)：355-65.

5 Zamore PD.Ancient pathways programmed by small RNAs〔J〕.Science，2002;296(5571)：1265-9.

6 Semizarov D，F(xiàn)rost L，Sarthy A，et al.Specificity of short interfering RNA determined through gene expression signatures〔J〕.Proc Nutl Acad Sci USA，2003;100(11)：6347-52.

7 Jackson AL，Bartz SR，Schelter J，et al.Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNA〔iJ〕.Nat Biotechnol，2003;21(6)：635-7.

8 Sun XG，Song G，Liu JH，et al.Construction of plasmid vector with Tat and its ability to transducer fusion protein into cells〔J〕.Chin J Biochem Mol Biol，2003;19(3)：354-8.

Construction and identification of FGF-21 siRNA recombinant adenovirus vector

YANG Xiao-Min，YANG Gang-Yi，LI Ling，et al.
Department of Endocrinology，the Second Affiliated Hospital，Chongqing University of Medical Science，Chongqing 400016，China

Objective To construct the RNA interference adenovirus expression vector specific for fibroblast growth factor-21(FGF-21)gene.Methods Firstly，the plasmid pSilencer1.0-shFGF-21 developed a vector-based system in earlier studies was digested by BamHⅠ+HindⅢ for getting the fragment.The adenovirus vector plasmid，pAd-shFGF-21 was constructed according to a two-step transformation protocol.The newly constructed plasmid was transfected into 293 packaging cells to grow adenovirus，which was further multiplied and purified.Results The recombinant adenoviral plasmid pAd-shFGF-21 was successfully constructed.The titer of the purified pAd-shFGF-21 was 1×1010PFU/mL.Conclusions The RNA interference adenovirus expression vector specific for FGF-21 gene is established successfully.

RNA interference;Adenovirus vector;FGF-21;Adiponectin

R329.25;394.3

A

1005-9202(2012)23-5173-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.23.033

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30771037，30871199，30971388，81070640)

1 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科

李 伶(1962-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的基因診斷及治療研究。

楊小敏(1989-)，女，碩士，主要從事糖脂代謝紊亂與胰島抵抗研究。

〔2012-02-16收稿 2012-06-16修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)