金旭鵬 郭蓮怡 (遼寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，遼寧 錦州 121000)

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物活性的細(xì)胞因子，參與抗感染、發(fā)熱、休克等多種病理生理過程〔1〕。TNF-α也是引起重癥肝病發(fā)生發(fā)展的重要因子〔2〕。肝腎綜合征(HRS)是繼發(fā)于重癥肝病的腎衰竭，多種因素參與其發(fā)病〔3〕。腎血管收縮引起的腎血流量銳減是HRS的主要發(fā)病因素。腎血流量受腎小球入球小動脈收縮和舒張的控制，而腎入球動脈平滑肌細(xì)胞(RASMCs)內(nèi)Ca2+水平高低與腎入球動脈的舒縮功能直接相關(guān)。本研究觀察TNF-α對RASMCs內(nèi)鈣離子濃度(〔Ca2+〕i)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 200～250 g普通級雄性SD大鼠(由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，許可證號：SCXK(遼2003-0007)，開放系統(tǒng)飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h。進(jìn)行原代RASMCs的分離與培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 Fluo-3/AM乙酰甲酯、TNF-α、2-氨基乙基二苯硼酸鹽(2-APB)、內(nèi)皮素(美國 Sigma公司)、PSS緩沖液(PSS：0.1 mmol CaCl2，125.0 mmol NaCl2，5.0 mmol KCl，1.0 mmol MgCl2，10.0 mmol Glucose，20.0 mmol HEPES)。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)器材 CK30-12PHP相差顯微鏡，日本OLYMPUS;JEM-1200EX電鏡，日本;激光共聚焦顯微鏡(Uitma212型)，Meridina公司;MetaFlour4.5軟件，德國Carl Zeiss公司。

1.4 方法

1.4.1 參照文獻(xiàn)〔4〕行大鼠RASMCs的分離與培養(yǎng) 戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，摘除腎臟，留取皮質(zhì)，應(yīng)用篩網(wǎng)和酶消化法分離RASMCs，最后加入完全營養(yǎng)液，并以1×104細(xì)胞數(shù)接種于25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)，于CO2孵箱中培養(yǎng)，前3 d每天換液，以后隔天換液，1 w后可行細(xì)胞傳代。相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，取3～10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 RASMCs電鏡標(biāo)本制備 培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長至單層融合后，加1 ml胰酶消化、吹打，將細(xì)胞收于1 ml EP管中，1 500 r/min 4℃ 離心 4 min，棄上清，小心加入 1 ml PBS，1 500 r/min 4℃離心4 min，棄上清，小心加入1 ml 2.5%戊二醛固定2 h，1%鋨酸后固定1 h，常規(guī)丙酮脫水，經(jīng)浸透、樹脂包埋、超薄切片，醋酸鈾染色，JEM-1200EX電鏡觀察。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 TNF-α處理(0 h，24 h)分2組：ET刺激組(A1)：實(shí)驗(yàn)中加入 ET(100 nmol/L)刺激，不加 TNF-α;TNF-α +ET 刺激組(A2)：實(shí)驗(yàn)前24 h 加入 TNF-α(100 μg/L)，實(shí)驗(yàn)中加入 ET(100 nmol/L)刺激。2-APB阻斷分2組：2-APB+ET刺激組(B1)：加 ET前10 min加入2-APB，實(shí)驗(yàn)中加入ET(100 nmol/L)刺激;TNF-α+2-APB+ET刺激組(B2)：實(shí)驗(yàn)前24 h加入 TNF-α(100 μg/L)，加 ET前 10 min加入 2-APB(30 μmol/L)，實(shí)驗(yàn)中加入 ET(100 nmol/L)刺激。

1.4.4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的測定〔5〕各組細(xì)胞均加入鈣離子熒光探針Fluo-3/AM(5 μmol/L)，F(xiàn)luo-3/AM可以和鈣離子結(jié)合，產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，采用confocal顯微鏡測定單個活細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度(發(fā)射波長505 nm，激發(fā)波長488 nm)。動態(tài)觀察各組細(xì)胞胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度(FI)的變化。采用LSM510軟件對數(shù)據(jù)、圖形進(jìn)行實(shí)時動態(tài)測量與分析，根據(jù)給藥前后單個細(xì)胞的FI值計算出細(xì)胞內(nèi)〔Ca2+〕i。每組設(shè)2個平皿，并用不同代細(xì)胞重復(fù)3次。依據(jù)Grynkiewicz公式，計算〔Ca2+〕i。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析，計量數(shù)據(jù)以s表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 RASMCs的鑒定 原代培養(yǎng)的RASMCs大小不等，形狀多樣，呈梭形或者三角形等形狀;傳代培養(yǎng)的RASMCs形態(tài)多呈梭形或者長梭形。透射電鏡見細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)大量縱行束樣分布的肌絲，上述結(jié)果表明所獲細(xì)胞為RASMCs。見圖1。

圖1 RASMCs的生長情況

2.2 RASMCs內(nèi)〔Ca2+〕i的測定 各組細(xì)胞加ET刺激前，即靜息狀態(tài)下〔Ca2+〕i無顯著差異(P＞0.05)，亦未發(fā)生自主性上升，只是因指示劑的衰減，熒光強(qiáng)度略有遞減的趨勢。加ET刺激后，A1組RASMCs在短時間內(nèi)(約1 min)鈣離子濃度迅速、顯著增加(即峰值升高相)，與加 ET前比較有顯著差異(P＜0.01);A2組RASMCs內(nèi)〔Ca2+〕i上升明顯增強(qiáng)，與 A1組比較差異顯著(P＜0.01)。B1及B2組RASMCs內(nèi)〔Ca2+〕i無明顯變化，與加ET前比較無顯著差異(P＞0.05);與A1組加ET后比較差異顯著(P＜0.01)。見表1。

表1 各組RASMCs內(nèi)〔Ca2+〕i的變化( s，nmol/L)

表1 各組RASMCs內(nèi)〔Ca2+〕i的變化( s，nmol/L)

與加ET前比較：1)P＜0.01;與A1組加ET后比較：2)P＜0.01

組別 加ET前(靜息狀態(tài))加ET后A1 109.51±52.63 240.36±56.781)A2 128.07±78.56 375.45±60.392)B1 112.69±57.76 101.66±48.032)B2 126.61±83.92 116.35±53.482)

3 討論

HRS是重型肝炎和嚴(yán)重肝病最常見的并發(fā)癥〔6〕。腎入球動脈平滑肌的舒縮對于腎皮質(zhì)血流量的調(diào)節(jié)具有直接作用。本研究探討TNF-α對RASMCs收縮及胞內(nèi)Ca2+的影響。應(yīng)用酶消化及篩網(wǎng)技術(shù)提取RASMCs，并進(jìn)行原代培養(yǎng)，通過透射電鏡觀察胞質(zhì)內(nèi)的肌絲證實(shí)已成功分離培養(yǎng)RASMCs。

當(dāng)HRS發(fā)生時，患者血清中內(nèi)皮素等多種縮血管活性物質(zhì)水平明顯增高，并可直接或通過間接途徑引起腎血管收縮，是導(dǎo)致腎血流灌注和腎功能紊亂的重要介質(zhì)。血管平滑肌的舒縮直接受細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響〔7〕，高濃度Ca2+可引起細(xì)胞收縮，低濃度Ca2+可引起細(xì)胞舒張，因此監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)〔Ca2+〕i變化能反映細(xì)胞的舒縮狀態(tài)。最近的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)胞因子可以使細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增高，使效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生生物反應(yīng)〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明 TNF-α可使內(nèi)皮素刺激后的胞內(nèi)〔Ca2+〕i增高。

1，4，5-三磷酸肌醇受體(IP3R)是平滑肌細(xì)胞內(nèi)主要的Ca2+釋放通道，當(dāng)某些縮血管活性物質(zhì)作用于細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)高水平的IP3，增高的IP3與IP3R結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)儲備Ca2+釋放，結(jié)果使效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生生物反應(yīng)〔9〕。當(dāng)HRS發(fā)生時，許多縮血管活性物質(zhì)(如內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、血管加壓素、血栓素A2、白三烯等)明顯增高〔10〕，作用于平滑肌細(xì)胞，引起胞內(nèi)IP3水平增高，而致腎血管收縮。本研究結(jié)果顯示，TNF-α增強(qiáng)內(nèi)皮素刺激引起胞內(nèi)Ca2+釋放的作用可被2-APB阻斷。故認(rèn)為TNF-α間接影響胞內(nèi)〔Ca2+〕i，是通過IP3R來起作用的。綜上所述，內(nèi)皮素刺激可使RASMCs在短時間內(nèi)胞內(nèi)〔Ca2+〕i迅速、顯著增加。TNF-α作用后上述效應(yīng)明顯增強(qiáng)，且此效應(yīng)可被2-APB阻斷，證明了TNF-α可增強(qiáng)內(nèi)皮素刺激引起的胞內(nèi)鈣離子釋放進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞收縮，引起腎小球入球小動脈收縮，腎血流量減少，腎小球?yàn)V過率降低，參與HRS發(fā)生。上述研究不僅證明內(nèi)皮素是通過激動IP3R而產(chǎn)生效應(yīng)的;也證明了TNF-α可增強(qiáng)內(nèi)皮素刺激引起的胞內(nèi)Ca2+釋放，且這一作用也是通過IP3R來調(diào)節(jié)的。

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