侯 波 趙敬秋 (吉林省人民醫(yī)院急診外科，吉林 長春 3002)

血管緊張素原(angiotensinogen，AGT)是一種球狀糖蛋白，主要在肝臟合成，作為腎素底物在調(diào)節(jié)血壓方面發(fā)揮重要作用。此外，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)AGT能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和血管形成，基因?qū)?AGT能夠阻斷腫瘤生長和轉(zhuǎn)移〔1，2〕。以往多項(xiàng)研究調(diào)查了AGT基因M235T多態(tài)性與多種腫瘤的相關(guān)性〔3～7〕，然而，其與中國人群胃癌相關(guān)性未見報(bào)道。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCRRFLP)技術(shù)檢測中國人群胃癌患者AGT基因M235T多態(tài)性，旨在探索AGT基因M235T多態(tài)性與胃癌的關(guān)系，為探討胃癌發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 我院2008年1月至2010年12月收治胃癌患者168例，男101例，女67例，平均(58.9±13.5)歲，均經(jīng)組織病理學(xué)確診。其中臨床Ⅰ～Ⅱ期97例，Ⅲ～Ⅳ期71例;高中分化104例，低分化64例;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移71例，無轉(zhuǎn)移97例。對(duì)照組為健康體檢者211例，男137例，女74例，平均(56.5±11.6)歲，無腫瘤家族史，各項(xiàng)體檢指標(biāo)均正常，所有個(gè)體均為無血緣關(guān)系漢族人群。

1.2 主要試劑 全血基因組DNA提取試劑盒購自北京百泰克生物科技公司。TaqDNA聚合酶，dNTP和MgCl2等購自北京天根生物科技有限公司。參照文獻(xiàn)〔8〕設(shè)計(jì)引物。上游引物：5'-CAGGGTGCTGTCCACACTGGACCCC -3'，下 游 引 物：5'-CCGTTTGTGCAGGGCCT GGCTCTCT-3'。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 PCR-RFLP分型 采集入選對(duì)象者外周靜脈血2 ml，采用全血基因組DNA提取試劑盒提取DNA。運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)對(duì)AGT M235T進(jìn)行分型。PCR 反應(yīng)體系為 25 μl，含10 × 反應(yīng)緩沖液3.0 μl，dNTP 2.5 μl，MgCl21.5 μl，上、下游引物各 0.25 μl，TaqDNA 聚合酶 1.0 U，基因組DNA 1.5 μl，用無菌去離子水補(bǔ)足至25 μl。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性4 min;94℃變性 30 s，67℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶TthIII I酶切，酶切產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，分析判讀結(jié)果。MM型有1條帶：165 bp;MT型3條帶：165、141和24 bp;TT型2條帶：141和24 bp，其中24 bp跑至膠外。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)法計(jì)算基因型和等位基因頻率，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律用于檢測基因型的遺傳平衡狀態(tài)，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組AGT M235T基因型和等位基因分布 兩組基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡，表明入選對(duì)象具有較好的群體代表性，見表1。

2.2 兩組基因型和等位基因頻率比較 兩組基因型和等位基因頻率差異不顯著(P＞0.05)。根據(jù)臨床病理特征進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)低分化胃癌患者TT基因型頻率明顯高于高中分化(P=0.021);AGT M235T多態(tài)性與胃癌臨床分期及轉(zhuǎn)移狀態(tài)之間差異不顯著(P＞0.05)(見表2)。

表1 胃癌組與對(duì)照組AGT M235T多態(tài)性比較〔n(%)〕

表2 胃癌組臨床病理特征與AGT M235T多態(tài)性比較

3 討論

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是一個(gè)復(fù)雜的多層次內(nèi)分泌系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)血壓和穩(wěn)定體液平衡方面發(fā)揮極為重要的作用。AGT作為RAS系統(tǒng)中第一步限速反應(yīng)底物，不僅參與人體血壓調(diào)節(jié)，而且能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和腫瘤血管形成〔1，2〕，導(dǎo)入AGT有望成為新的腫瘤基因治療方法。

鑒于AGT在抑制腫瘤生長方面的重要作用，多項(xiàng)研究分析了AGT基因M235T多態(tài)性與腫瘤相關(guān)性〔3～7〕。Gonzalez-Zuloeta等〔7〕報(bào)道在荷蘭人群中，AGT M235T多態(tài)性M等位基因增加了絕經(jīng)后婦女乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。Mendizabal-Ruiz等〔5〕報(bào)道在墨西哥人群中，AGT M235T多態(tài)性與乳腺癌發(fā)病無關(guān)。Vairaktaris等〔3〕報(bào)道在德國和希臘人群中，導(dǎo)致AGT基因表達(dá)增加的235T等位基因與口腔癌發(fā)病無關(guān)。Shibata等〔4〕報(bào)道在日本人群中，AGT M235T多態(tài)性在胃癌組和對(duì)照組中分布無明顯差異。本研究未發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性位點(diǎn)與胃癌存在明顯相關(guān)性，與Shibata等〔4〕結(jié)果一致，提示存在其他胃癌易感基因。本研究結(jié)果表明攜帶TT基因型胃癌患者惡性程度更高，預(yù)后更差。綜上，盡管AGT M235T多態(tài)性與中國人群胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)，但其與胃癌分化程度密切相關(guān)。本研究尚存在一些局限，比如樣本量相對(duì)較少，尤其在分層分析中，而且局限于單一種族，有待于多中心、多種族、大樣本的病例-對(duì)照研究加以證實(shí)。

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