劉金鳳 馬洪勝 李 峰 (濰坊市人民醫(yī)院，山東 濰坊 261599)

冠心病 (CHD)的發(fā)生是遺傳與環(huán)境共同作用的結(jié)果。高脂血癥是CHD的主要危險(xiǎn)因素之一。近年研究表明，ApoE基因多態(tài)性與血脂水平存在相關(guān)性，與動脈粥樣硬化程度及CHD的發(fā)生密切相關(guān)〔1〕。本研究選擇濰坊地區(qū)漢族人88例CHD患者與75例健康對照者為研究對象，用限制性片段長度多態(tài)性 (PCR-RFLP)方法檢測ApoE常見基因型及在人群中的分布頻率，從分子水平探討ApoE基因遺傳多態(tài)性與脂質(zhì)代謝的關(guān)系，為脂質(zhì)代謝紊亂的防治以及CHD的預(yù)防和治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 CHD組88例，按WHO1979年制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為CHD，均來自我院老年病科與心血管內(nèi)科門診和病房的濰坊地區(qū)漢族人，其中男性56例，女性32例，平均年齡 (56.7±8.1)歲，均排除家族性高膽固醇血癥、脂肪肝、糖尿病、甲狀腺疾病、腎臟疾病、嚴(yán)重高血壓和肝臟疾病;對照組75例，為我院體檢健康成人，其中男48例，女27例，其平均年齡 (56.2±9.7)歲。

1.2 標(biāo)本采集及檢測

1.2.1 標(biāo)本采集 抽取空腹12～14 h肘靜脈血4 ml分裝，其中3 ml于普通抗凝試管中分離血清，3 h內(nèi)送檢血脂，余1 ml置0.5%EDTA抗凝管中－20℃冷藏保存同批待測基因型。

1.2.2 PCR及主要試劑 所使用的ApoE的基因位點(diǎn)引物按Tasi等〔2〕報(bào)道設(shè)計(jì)并使用由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供的合成引物一對。引物序列為：上游引物5'-ACAGAATTCGC CCCGGCCTGGTACAC-3'，下游引物：5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGGA-3'。

1.2.3 目的DNA片段的PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物檢測 參照改良HixsonJE法進(jìn)行PCR擴(kuò)增〔3〕;硝酸銀 (0.1%)染色檢測ApoE基因PCR產(chǎn)物 (244 bp);限制性內(nèi)切酶 (HhaI)酶切：反應(yīng)在25 μl體系中進(jìn)行，其中包括PCR產(chǎn)物19 μl，限制性內(nèi)切 酶 HhaI 11 μl(10 U/μl，Sangon 公 司)，10 × buffer 2.5 μl，混勻后置37℃水浴，消化4 h后，置于－20℃終止酶切;聚丙烯酰胺凝膠電泳分型;利用AU600 Olympus全自動生化分析儀上進(jìn)行六項(xiàng)血脂測定。

2 結(jié)果

2.1 CHD組和對照組ApoE基因型及等位基因比較 見表1。CHD組患者中 ApoE基因型依次為 E3/3＞E2/3＞E2/4＞E3/4＞E4/4;對照組ApoE基因型分布依次為E3/3＞E3/4＞E2/3，未檢測出E2/4和E4/4型。兩組中均以E3/3基因型組最常見，兩組均未檢測出E2/2基因型。CHD組中ApoE等位基因頻率依次為ε3＞ε4＞ε2，對照組ApoE等位基因頻率為ε3 ＞ ε2 ＞ ε4。

2.2 不同基因型的CHD患者血脂脂蛋白水平比較 見表2。不同基因型的CHD患者TC、LDL-C、HDL-C、ApoB水平均存在差異，E4/3、E4/4型個體TC、LDL-C最高，與E3/3、E2/3、E2/4型比較差異顯著 (P＜0.01，P＜0.05)，E2/3型個體TC、LDL-C水平最低，與 E3/3、E2/4型比較差異顯著(P＜0.01，P＜0.05)。E3/4、E4/4型個體HDL-C水平顯著低于E2/3組 (P＜0.05)。E3/4、E4/4型個體 ApoB水平顯著高于E3/3、E2/3組 (P＜0.01)。TG、ApoA1水平各基因型組無差異 (P＞0.05)。

2.3 不同基因型的對照組血脂脂蛋白水平比較 見表2。不同基因型的對照組TC、ApoB水平存在差異，TC水平E3/4型顯著高于E3/3、E2/3型 (P＜0.01);ApoB水平E3/4顯著高于E3/3(P＜0.05)，其余各項(xiàng)指標(biāo)各基因型組無差異 (P＞0.05)。

表1 CHD組和對照組ApoE基因型及等位基因比較〔n(%)〕

表2 不同基因型的CHD、對照組患者血脂脂蛋白水平比較( s，mmol/L)

表2 不同基因型的CHD、對照組患者血脂脂蛋白水平比較( s，mmol/L)

與 E3/3比較：1)P ＜0.01，2)P ＜0.05

E基因型 CHD組TC TG HDL-C LDL-C ApoA1 ApoB E3/4和E4/45.74±0.781)2.12±0.61 0.89±0.35 3.88±0.722)1.22±0.28 1.15±0.181)5.52±0.671)1.46±0.61 1.17±0.51 3.54±0.75 1.24±0.36 0.97±0.171)TC TG HDL-C LDL-C ApoA1 ApoB 對照組E3/3 5.13±0.45 1.94±0.73 0.96±0.25 3.49±0.84 1.25±0.36 0.97±0.23 5.11±0.52 1.20±0.47 1.34±0.22 3.21±0.67 1.25±0.18 0.86±0.13 E2/3 4.85±0.542)2.03±0.88 1.17±0.252)2.87±0.661)1.18±0.29 0.83±0.141)4.82±0.71 1.02±0.42 1.47±0.25 2.78±0.54 1.23±0.61 0.79±0.18 E2/4 5.22±0.72 1.92±0.76 1.12±0.39 3.11±0.47 3.11±0.47 1.08±0.231)－ － － － － －

3 討論

高脂血癥是CHD和動脈粥樣硬化(AS)的主要危險(xiǎn)因素。研究表明，載脂蛋白與機(jī)體脂質(zhì)和脂蛋白代謝存在相關(guān)性，迄今發(fā)現(xiàn)的載脂蛋白有近20種，而以ApoE基因多態(tài)性與高脂血癥及CHD的關(guān)系最為密切。

研究表明：正常人群中6種ApoE表型或基因型分布不均勻，但有其共同特點(diǎn)：在一般人群中ApoE3/3分布頻率最高，發(fā)生頻率大多超過60%，含ApoE3的雜合子(E3/4，E2/3)居中，約占30%，ApoE2/2，ApoE4/4和ApoE2/4發(fā)生頻率最低，三者之和一般不超過10%〔5〕。ApoE基因頻率不存在性別差異，但存在種族差異〔6〕。亞洲人群中ε4等位基因頻率較低(日本0.06，新加坡0.096)〔1〕，本研究顯示，E2/4 型個體所占比例較高，與以往國內(nèi)外研究報(bào)告不同。對照組ApoE等位基因頻率與上述研究結(jié)果基本一致，支持亞洲人群中ε4等位基因的頻率較歐美人種低的論點(diǎn)。而在冠心病人群中ε4等位基因的頻率明顯高于健康組，ε2頻率則相反，提示 ApoE ε2、ε4等位基因可能是CHD的遺傳易感基因。

ApoE基因是決定血膽固醇水平的最重要的遺傳因素之一〔6〕。膽固醇變異的14% ～16%歸因于ApoE基因多態(tài)性〔7〕，ε4等位基因與高水平的TC、LDL-C、ApoB和低ApoE水平顯著相關(guān)，而ε2等位基因的作用恰恰相反，ε2人群往往血清 TC、LDL-C水平最低，ε4人群血清TC、LDL-C水平最高，ε3人群位于二者之間〔8〕。此結(jié)論表明ApoE基因型影響個體間血漿TC的作用不受環(huán)境和其他遺傳背景的干擾。本研究認(rèn)為，ApoE4則為高膽固醇血癥的易感因子。ApoE基因多態(tài)性與血漿HDLC的關(guān)系各家研究結(jié)論不一。Eggertsen等〔9〕研究認(rèn)為，ApoE基因多態(tài)性與HDL-C無相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)ApoE基因與HDL-C水平關(guān)系呈現(xiàn) E3/4、E4/4、E3/3、E2/4、E2/3 型依次遞增的趨勢。

ApoE基因多態(tài)性對血漿TG水平的影響各方研究結(jié)論不一〔7〕。一般認(rèn)為，在整個人群中E2/2、E4/4、E2/4者的血漿TG明顯高于E 3/3者，提示ε2、ε4等位基因均與血漿高TG濃度有關(guān)。但朱鐵兵等〔10〕研究結(jié)論與之相左，認(rèn)為ε4對TG并無明顯影響。我們研究發(fā)現(xiàn)無論CHD患者還是健康人，TG水平各基因型組無差異。

ApoE基因?qū)d脂蛋白也有重要影響。普遍研究認(rèn)為，ApoB變異的12%可以由ApoE基因多態(tài)性解釋，ApoA1的變化與ApoE基因型的關(guān)系依下列順序遞降：E2/2＞E2/3＞E2/4＞E3/3＞E3/4＞E4/4。本研究發(fā)現(xiàn)，無論CHD患者還是健康人，不同基因型組個體ApoA1水平并無顯著差異，而攜帶ε4等位基因個體ApoB水平顯著高于ε2、ε3等位基因個體。

ApoE基因引起血脂差異的機(jī)制尚不十分清楚，研究認(rèn)為可能與各種ApoE受體結(jié)合能力強(qiáng)弱、影響含ApoE的脂蛋白代謝速度有關(guān)。ApoE主要在乳糜微粒(CM)中起重要作用。這有助于將外周的膽固醇運(yùn)送到肝臟經(jīng)過代謝排出。研究發(fā)現(xiàn)，ApoE的異構(gòu)體與LDL受體的結(jié)合能力不同，與野生型ε3相比(即以野生ApoE為100%)，ε2為＜2%，即幾乎沒有與LDL受體結(jié)合的能力，從而導(dǎo)致富含TG的脂蛋白分解較慢，CM殘?bào)w清除減慢，使血中的TG升高;而由ApoE介導(dǎo)的LDL轉(zhuǎn)化為LDL的速度減慢，細(xì)胞LDL受體上調(diào)造成的LDL外周分解代謝加快以及由LDL受體介導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)吞LDL速度加快，使得ApoE2等位基因攜帶者的TC及LDL水平下降〔11〕。而ApoE4與LDL受體的結(jié)合能力則為23%。由于ApoE2與受體的結(jié)合能力低以及肝臟攝取處理CM微粒、VLDL殘粒發(fā)生障礙，血中的VLDL富含TG，表現(xiàn)為高甘油三酯血癥：另一方面，肝臟中的膽固醇相對較少，LDL受體上調(diào)，肝臟攝取血循環(huán)中的LDL較低，由于總膽固醇主要取決于LDL水平，所以ApoE2等位基因攜帶者往往表現(xiàn)為低總膽固醇和低LDL。而關(guān)于不同的ApoE異構(gòu)體影響血脂調(diào)節(jié)功能的機(jī)制，主要是由于ApoE在發(fā)生氨基酸取代后，改變了受體結(jié)合區(qū)域的電荷，從而影響受體的結(jié)合能力所致〔12〕。

1 Siest G，Pillot T，Bailly A，et al.Apolipoprotein E：an important gene and protein to follow in labratory medicine〔J〕.Clin Chem，1995;41：1068-86.

2 Rall SC，Weisghaber KH，Mahley RW.Human apolipoprotein E：the complete amino acid sequence〔J〕.J Biol Chem，1982;257：4171-9.

3 馮 穎，許賢豪，冀成君.阿爾茨海默病相關(guān)基因載脂蛋白E的多態(tài)性分析〔J〕. 中華神經(jīng)科雜志，1998;31：139-42.

4 Boerwinkle E.The use of measured genotype information in the analysis of quantitative phenotypes in man：simultaneous estination of the frequence and effects of apolipoprotein E polymorphisn and residual polygenetic effects on cholesterol，beta-lipoprotein and triglyceride levels〔J〕.Ann Hum Genet，1987;51：211-26.

5 Hallman DW，Boerwinkle E，Saha N，et al.The apolipoprotein E polymorphism：a comparison of allele frequenceies and effects in nine populations〔J〕.Am J Hum Genet，1991;49：338-46.

6 Dallongeville J，Cacan SL，Davignon J.Modulation of plasma triglyceride level by apoE phenotype analysis〔J〕.J Lipid Res，1992;33：447-54.

7 Davignon J，Gregg RE，Sing CF.Apolipoprotein E polymorphism and atherosclerosis〔J〕.Curr Sci，1993;5(1)：1-21.

8 James M，Hagberg B，Kenneth RW，et al.ApoE gene and gene-environment effects on plasma lipoprotein lipid levels〔J〕.Physlol Genomics，2000;4：101-8.

9 Eggertsen G，TegelmanR，Ericsson S，et al.Apolipoprotein E polymorphism in a healthy population：variation of allele frequency with age and relation to serum lipid concentrations〔J〕.Clin Chem，1993;39：2125-9.

10 朱鐵兵，王中林，趙水平，等.載脂蛋白E基因?qū)ρx的調(diào)節(jié)及其與冠心病的關(guān)系〔J〕.湖南醫(yī)科大學(xué)報(bào)，1998;23(2)：149-51.

11 Kataoka S，Robbins DC，Cowa LD，et al.Apoliloprotein E poly morphismin American Indians and its relation to plasma lipoproteins and diabetes：the strong heart study〔J〕.Arteriosler Thromb Vasc Biol，1996;16：918-21.

12 Srinivasan SR，Lhnholm C，Wattigney W，et al.Apolipoprotein E polymorphism and its association with serum lipoprotein concentration in black versus white children：The Bogalusa Heart Study〔J〕.Metabolism，12：381-6.