劉亮劉英波周英信丁斗潘年松馮華

1．貴州省遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，貴州 遵義 563002;2．貴州省遵義市藥品檢驗(yàn)所，貴州 遵義 563000

天冬中總氨基酸的含量測定

劉亮1劉英波1周英信1丁斗1潘年松1馮華2

1．貴州省遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校，貴州 遵義 563002;2．貴州省遵義市藥品檢驗(yàn)所，貴州 遵義 563000

目的:建立天冬中總氨基酸含量測定的方法。方法:以天冬素為對(duì)照品，2%茚三酮及pH=6．8磷酸二氫鉀－氫氧化鈉緩沖液為顯色劑，置沸水中顯色15min，于566nm下測定吸光度。結(jié)果:天冬素的質(zhì)量濃度在4～14μg·mL－1與吸光度成良好線形關(guān)系，r=0.9994(n=6)，平均回收率為100.59%，RSD=2.47%。結(jié)論:該法可用于天冬的含量測定。

天冬;總氨基酸;含量測定

天冬為百合科植物天門冬Asparagus cochinchinensis(Lour．)Merr．的塊根，是一種臨床常用中藥，具有養(yǎng)陰清熱，潤肺滋腎的功效，臨床上多用于治陰虛發(fā)熱、咳嗽吐血、肺癰、咽喉腫痛、消渴、便秘等病癥。天冬中所含化學(xué)成分主要有氨基酸類、糖類、螺甾甙類。通過查閱文獻(xiàn)，我們發(fā)現(xiàn)氨基酸類具有抗腫瘤活性，但其含量測定方面的研究較少［1］，難以進(jìn)行深入開發(fā)。本文通過紫外法，以天冬素為對(duì)照品對(duì)天冬中總氨基酸的含量測定進(jìn)行了方法學(xué)的考察，為天冬的質(zhì)量控制提供了新思路，新嘗試。

1 儀器與試藥

Aquelix 5型實(shí)驗(yàn)室高純水系統(tǒng)(重慶市金富科技發(fā)展有限公司)，UV2501紫外分光光度計(jì)(日本島津);DKS－26型電熱恒溫水浴鍋(寧波江南儀器廠);FA2004B型電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司);SHZ－DⅢ型予華牌循環(huán)水真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);FW200型高速萬能粉碎機(jī)(北京科偉永興儀器有限公司)。

天冬素購于上海華壹生物科技有限公司(批號(hào):70－47－3);天冬藥材購于貴州遵義，經(jīng)遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校張學(xué)愈副教授鑒定為百合科植物天冬Asparagus cochinchinensis(Lour．)Merr．的塊根;所用水為高純水，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 茚三酮溶液的配制(2%)

稱取茚三酮2.0g加乙醇溶解，定容至100mL。

2.1.2 磷酸鹽緩沖液的配制(pH=6.8)

精密稱取磷酸二氫鉀3.4022g及氫氧化鈉0.4720g混合加水使其溶解，定容至500mL。

2.1.3 天冬素對(duì)照溶液的配制

精密稱取天冬素0.0100g加水使其溶解，定容至100mL。此溶液濃度為0.1mg/mL。

2.1.4 供試溶液的制備

精密稱取天冬藥材粗粉1克，加水50mL，超聲提取30min，抽濾，濾液定容至100mL。

2.2 測定波長的選擇

分別精密吸取對(duì)照溶液、供試溶液適量于25mL容量瓶中，加水至10mL，再分別加入磷酸鹽緩沖液2mL和茚三酮溶液2mL，搖勻，置于沸水中顯色15min，取出后立即用冰水冷卻5min，用水定容至刻度，搖勻，靜置10min，在400～800nm進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示對(duì)照溶液在577nm處有最大吸收(圖1)，而供試溶液在566nm處有最大吸收(圖2)，故選擇566nm為本試驗(yàn)的測定波長。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密移取對(duì)照溶液0.0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0和3.5mL于25mL容量瓶中，加水至10mL，再分別加入磷酸鹽緩沖液2mL和茚三酮溶液2mL，搖勻，置于沸水中顯色15min，取出后立即用冰水冷卻5min，用水定容至刻度，搖勻，靜置10min，于566nm處測定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，天冬素在4～14μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為A=0.052314C－0.077162，r=0.9994。

2.4 穩(wěn)定定性試驗(yàn)

精密吸取樣品溶液1.0mL，按2.3項(xiàng)下的操作方法顯色，于566nm處分別在0，10，20，，40，60，90，120min測定吸光度。結(jié)果表明樣品液顯色后在120min內(nèi)穩(wěn)定，RSD=0.43%。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照溶液2mL，共6份，按2.3項(xiàng)下的操作方法顯色，于566nm處測定吸光度，計(jì)算RSD=0.57%。結(jié)果表明方法的精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品6份，按2.1.4項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下操作方法顯色，于566nm處測定吸光度，并計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為2.05%，RSD=1.08%。結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密吸取6份已知含量的樣品溶液0.5mL于25mL容量瓶中，加入對(duì)照品溶液1.0mL，按2.3項(xiàng)下操作方法顯色，于566nm處測定吸光度，結(jié)果見表1。

表1 天冬加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8 樣品的含量測定

按照2.1.4項(xiàng)下操作方法，制備3批供試溶液，按2.3項(xiàng)下操作方法顯色，于566nm處測定吸光度，3批藥材中總氨基酸的含量分別為:2.07%，2.07%，2.06%，RSD=0.35%。

3 討論

根據(jù)文獻(xiàn)的查閱［2－4］，試驗(yàn)前期比較了醋酸－醋酸鈉(pH=5.5)、磷酸二氫鉀－磷酸氫二鈉(pH=8.04)及磷酸二氫鉀－氫氧化鈉(pH=6.8)三種緩沖液對(duì)顯色穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明醋酸－醋酸鈉(pH=5.5)緩沖液條件下生成物不穩(wěn)定，吸光度值在短時(shí)間內(nèi)下降很快。后兩種緩沖液條件下相比較而言，磷酸二氫鉀－氫氧化鈉(pH=6.8)穩(wěn)定性最好，故選為本試驗(yàn)反應(yīng)條件。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間。本法具有操作簡單，準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，為天冬的質(zhì)量控制提供了新的有效手段。

［1］ 馬家驄，項(xiàng)勤，劉浙創(chuàng)等．異硫氰酸苯柱前衍生法測定天冬中天冬素含量［J］．科技通報(bào)，1990，6(3):152－154．

［2］ 胡京枝，董小海，于大杰．紫外分光光度法測定含乳飲料中游離氨基酸含量［J］．中國食品添加劑，2007，18(6):164－167．

［3］ 朱瑾，李新霞，陳堅(jiān)．茚三酮比色法測定蒜氨酸原料藥中總氨基酸的含量［J］．西北藥學(xué)雜志，2008，23(3):136－138．

［4］ 梁英麗，李艷，高孟婷等．西歸中總氨基酸含量測定方法的研究［J］．大理學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，8(10):7－9．

R927.2

A

1007－8517(2012)15－0045－02

貴州省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目，黔教科(2008)069號(hào);遵義醫(yī)藥高等專科學(xué)校自然科學(xué)科技項(xiàng)目，遵醫(yī)專科合(2011)Z01號(hào)。

劉亮(1981～)，男，講師，理學(xué)碩士，主要從事中藥、民族藥化學(xué)成分及質(zhì)量研究。

周英信，教授。Tel:13985235292。

2012.05.16)