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        超高壓與Alcalase協(xié)同作用制備牛乳清蛋白抗氧化肽

        2012-11-15 02:05:34盛小波木泰華
        食品工業(yè)科技 2012年1期
        關(guān)鍵詞:超氧乳清陰離子

        盛小波,木泰華

        (中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京100193)

        超高壓與Alcalase協(xié)同作用制備牛乳清蛋白抗氧化肽

        盛小波,木泰華*

        (中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京100193)

        為探討超高壓與堿性蛋白酶Alcalase協(xié)同作用下乳清蛋白抗氧化肽的制備,以牛乳清分離蛋白(WPI)為原料,采用Alcalase分別對100~600MPa的超高壓處理中和超高壓處理后的WPI進行水解,并采用鄰苯三酚自氧化法對其水解產(chǎn)物的超氧陰離子自由基清除能力進行測定。結(jié)果表明,超高壓與Alcalase協(xié)同作用顯著地促進了WPI的水解,其水解產(chǎn)物的抗氧化活性也顯著提高;分子量小于3ku的組分具有最強的超氧陰離子自由基清除能力,其半抑制濃度IC50值最小,為411.62μg/mL。因此,超高壓與Alcalase協(xié)同作用于乳清蛋白可用于開發(fā)新型天然抗氧化劑。

        超高壓,Alcalase,協(xié)同作用,抗氧化肽,半抑制濃度

        通常認為,機體內(nèi)自由基的含量變化是人類的許多疾病如心血管疾病、糖尿病、癌癥、衰老等的誘因,同時也是造成食品貨架期縮短和腐敗變質(zhì)等的根源之一[1]。目前,國內(nèi)常用的合成抗氧化劑主要有二丁基羥基甲苯(BHT)、丁基羥基茴香醚(BHA)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)及沒食子酸丙酸(PG)等。考慮到合成抗氧化劑對人體健康的潛在危害,世界各國對其在食品中的應(yīng)用都進行了嚴格限制[2],因而人們開始將目光轉(zhuǎn)向了合成抗氧化劑的替代品——高效的天然抗氧化劑。乳清蛋白是從干酪生產(chǎn)的副產(chǎn)物乳清中分離出來的一類重要蛋白質(zhì)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),乳清蛋白的水解產(chǎn)物具有較強的脂質(zhì)過氧化抑制作用[3]、氧自由基吸收能力(ORAC)[4]、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)/超氧陰離子/羥基自由基清除能力[5]。超高壓技術(shù)作為一種新型的食品非熱加工技術(shù),作用于蛋白溶液時可以使蛋白鏈變得伸展,進而暴露更多的酶切位點而有利于水解反應(yīng)的進行[6]。然而,目前尚未有關(guān)于超高壓作用下乳清蛋白的酶解產(chǎn)物抗氧化活性研究的報道。因此,為探討超高壓與蛋白酶協(xié)同作用對WPI水解產(chǎn)物抗氧化活性的影響,本研究采用Alcalase分別對超高壓處理中和超高壓處理后的WPI進行水解,并以常壓作為對照,探討不同壓力處理條件下WPI水解產(chǎn)物的抗氧化能力,以期為超高壓技術(shù)用于乳清蛋白抗氧化肽的開發(fā)與利用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        牛乳清分離蛋白(WPI) 美國Le Sueur Cheese公司,蛋白質(zhì)含量約為95%(w/w);堿性蛋白酶Alcalase 2.4L FG 丹麥NOVO公司,酶活力為2.4Au/g;鄰苯二醛 Sigma公司,優(yōu)級純;二硫蘇糖醇 北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司,優(yōu)級純;其它試劑 均為分析純。

        TGL-16M高速離心機 湖南湘儀儀器廠;KIELTEC凱氏定氮儀 瑞典ANALYSISER Foss公司;U-3010紫外可見分光光度計 日本HITACHI;LGJ-10冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠;HPP.L3-600/0.6超高壓食品處理裝置 天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 超高壓處理 WPI及其水解反應(yīng)的超高壓處理在超高壓處理裝置中進行。該裝置主要由超高壓主機系統(tǒng)、液壓泵站系統(tǒng)、電器控制系統(tǒng)和溫度控制系統(tǒng)組成,額定壓力600MPa,有效容積0.6L(60mm× 210mm),溫度控制范圍-10~60℃,以水作為壓力傳遞介質(zhì),高壓容器內(nèi)的溫度由夾套循環(huán)水進行自動控溫。實驗使用壓力分別為100、200、300、400、500、600MPa,在1~2min內(nèi)增至目標壓力并保持30min,處理結(jié)束后在1~2min內(nèi)將壓力卸至常壓。

        1.2.2 WPI水解產(chǎn)物的制備 稱取10g WPI干粉,溶入200mL 0.1mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)中,室溫下磁力攪拌溶解2h后,置于4℃冰箱中冷藏過夜使其充分水合。超高壓處理下WPI的水解反應(yīng)分為高壓處理中的水解和高壓處理后的水解兩種情形[7]。

        超高壓處理中WPI的水解:取WPI溶液20mL,按照酶與底物比E/S=5%(w/w)添加堿性蛋白酶Alcalase,并將其密封在聚氯乙烯袋中,混勻后迅速置于超高壓容器中進行處理。處理壓力分別為100、200、300、400、500、600MPa,處理溫度55℃,處理時間30min。

        超高壓處理后WPI的水解:取WPI溶液20mL,將其密封在聚氯乙烯袋中,迅速置于超高壓容器中進行處理。處理壓力分別為100、200、300、400、500、600MPa,處理溫度55℃,處理時間30min。處理結(jié)束后,迅速取出并按照酶與底物比E/S=5%(w/w)添加堿性蛋白酶Alcalase,混勻后置于55℃的水浴中反應(yīng)30min。

        對照組以未經(jīng)超高壓處理的WPI溶液作為底物在常壓下進行水解反應(yīng)30min。水解反應(yīng)結(jié)束后均迅速置于沸水浴中滅酶10min,冷卻后10000×g離心30min。取上清凍干置于-20℃冰箱中冷藏備用。

        1.2.3 水解度(DH)的測定 DH的測定采用Nielsen和Petersen的方法[8],其水解度的計算公式如下:

        式中:htot指每個蛋白質(zhì)中總的肽鍵數(shù),主要取決于原料的類型,乳清蛋白為8.8mmol/g蛋白質(zhì);h指每克蛋白質(zhì)中被水解的肽鍵數(shù),即mmol/g蛋白質(zhì)。

        1.2.4 鄰苯三酚自氧化法 水解產(chǎn)物的超氧陰離子自由基清除能力的測定采用Marklund等[9]的鄰苯三酚自氧化法進行。在試管中加入0.2mL樣品溶液和3.6mL 0.1mol/L的Tris-HCl(pH8.2,含有2mmol/L EDTA),混勻后于25℃水浴10min,加入0.2mL 3mmol/L的鄰苯三酚(預(yù)熱至25℃),迅速搖勻、計時,每隔30s記錄其在325nm波長下的吸光值A(chǔ)1,直至4min。以去離子水作為空白對照。超氧陰離子自由基清除能力的計算公式如下:

        式中:△A1為樣品溶液吸光度值隨時間的變化率,△A0為空白的自氧化速率。水解產(chǎn)物的抗氧化活性表示對超氧陰離子自由基的清除率達到50%時對應(yīng)的樣品濃度,即半抑制濃度,記為IC50。

        1.2.5 水解產(chǎn)物的超濾離心分離 取一定量凍干的WPI水解產(chǎn)物溶解在100mL去離子水中配置成抗氧化肽溶液,并依次采用截留分子量為10ku和3ku的超濾離心管在4000×g條件下離心20min,分別收集濾出液和截留液,將水解產(chǎn)物按分子量大小的差異分成Mw>10ku,10ku>Mw>3ku和Mw<3ku三個組分,凍干貯藏用于抗氧化活性的測定。

        1.2.6 統(tǒng)計分析 所有實驗均重復(fù)3次,實驗數(shù)據(jù)采用均值±標準差(Mean±SD),差異顯著性分析采用Duncan法,以P<0.05為顯著性檢驗標準。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 超高壓與Alcalase協(xié)同作用下WPI的水解度

        圖1顯示超高壓與Alcalase協(xié)同作用下WPI水解度隨壓力大小的變化情況。與常壓下的水解相比,無論是超高壓處理中的水解還是超高壓處理后的水解,WPI的水解度均有了顯著的提高(P<0.05),Otte,Bonomi和Chicón等[10-14]在研究高壓下β-乳球蛋白的水解時均得出了類似的結(jié)果。這可能是由蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化所導(dǎo)致,當超高壓作用于蛋白溶液時,蛋白鏈高度伸展而暴露出更多的酶切位點,進而有利于水解反應(yīng)的進行[6]。

        在300MPa的超高壓處理中,Alcalase對WPI的水解速率最大,僅30min其水解度即高達30.33%。這可能與Alcalase的底物專一性和抗壓性有關(guān)。Alcalase是由枯草芽孢桿菌Bacillus licheniformis產(chǎn)生的一種工業(yè)堿性蛋白酶,其主要成分是一種絲氨酸蛋白酶,具有廣泛的底物專一性,且優(yōu)先裂解疏水性氨基酸和芳香族氨基酸殘基側(cè)的肽鍵[15]。此外,Pen?s等在300MPa超高壓下采用Alcalase水解乳清蛋白研究其水解產(chǎn)物的致敏性時發(fā)現(xiàn),超高壓處理顯著地促進了乳清蛋白的水解,這表明Alcalase對高壓處理具有良好的抵抗性[7]。隨著壓力的升高,WPI的水解度開始下降,但在600MPa高壓下,Alcalase對WPI的水解度仍可達到22.76%,說明在超高壓處理中高濃度的蛋白溶液(5%,w/w)或許對酶的活性及其催化反應(yīng)具有一定的保護作用[16-17]。

        與超高壓處理中WPI的水解度相比,超高壓處理后WPI的水解速率明顯降低(P<0.05)。雖然400MPa超高壓處理后的WPI的水解度為21.17%,顯著高于常壓下的水解度14.43%,但仍遠低于超高壓處理中的WPI的水解度。這種差異的出現(xiàn)主要是由于壓力的存在有效地促進了酶與底物的結(jié)合和酶-水解產(chǎn)物復(fù)合物的分離[18-19],進而加快了Alcalase對WPI的水解速率。此外,超高壓處理的同時進行水解,還有利于蛋白酶對反應(yīng)生成的較大分子量的中間肽段的進一步水解,從而提高其水解程度[17]。然而,進一步增加壓力,超高壓處理后的WPI的水解度開始下降,這可能是由于過高的壓力導(dǎo)致的蛋白質(zhì)之間的聚集,進而阻礙了水解反應(yīng)的進行。

        圖1 超高壓與Alcalase協(xié)同作用下WPI的水解度變化情況Fig.1 The changes of degree of hydrolysis of WPI by using combined high pressure treatment and Alcalase digestion

        2.2 WPI水解產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除能力

        圖2表示超高壓與Alcalase協(xié)同作用下WPI水解產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除能力。在100~ 600MPa的超高壓處理中生成的WPI水解產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除能力顯著高于常壓下的水解產(chǎn)物,且同等壓力處理條件下,超高壓處理中生成的水解產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除能力也顯著大于高壓處理后生成的水解產(chǎn)物(P<0.05)。這可能是由于常壓下各蛋白酶的水解能力較低,蛋白鏈上的酶切位點有限,導(dǎo)致水解的不完全,而超高壓處理則使得蛋白鏈出現(xiàn)一定程度的伸展,暴露出更多的新的酶切位點[6],繼而產(chǎn)生了大量新的抗氧化活性肽。此外,在超高壓處理中進行水解,伴隨著蛋白酶對高度伸展的WPI的水解,還有助于蛋白酶進一步對水解過程中產(chǎn)生的較大疏水性中間肽的水解,進而生成了更多的小分子活性肽[17]。在400MPa高壓處理中生成的WPI水解產(chǎn)物具有最高的抗氧化活性,其IC50值最小,為582.15μg/mL,與常壓下WPI水解產(chǎn)物(IC50值1347.56μg/mL)相比,其對超氧陰離子自由基的清除能力提高了1.31倍。因此,為進一步研究超高壓與Alcalase協(xié)同作用下WPI水解產(chǎn)物的分子量分布對其抗氧化活性的影響,將此條件下的WPI水解產(chǎn)物采用超濾離心管進行分離并對不同組分的抗氧化效果進行分析。

        圖2 超高壓與Alcalase協(xié)同作用下WPI水解產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.2 The superoxide anion radical scavenging ability of WPI hydrolysates by using combined high pressure treatment and Alcalase digestion

        2.3 不同分子量WPI組分的抗氧化效果

        選用截留分子量分別為10ku和3ku的超濾離心管將具有最強抗氧化活性的WPI水解產(chǎn)物按照分子量分離出3個不同的組分后,收集并測定不同組分的IC50值。圖3表明400MPa高壓處理中WPI水解產(chǎn)物經(jīng)超濾離心得到三個不同組分的IC50值。在這三個組分中,Group-III組分表現(xiàn)出最強的抗氧化活性(P<0.05),其IC50值最小,為411.62μg/mL,顯著低于Group-II組分的674.51μg/mL和Group-I組分的1403.23μg/mL。這表明WPI水解產(chǎn)物中,分子量小于3ku的低分子肽類對其抗氧化活性起著重要的作用。這與Li和Ren等對鷹嘴豆蛋白和草魚肌肉蛋白水解產(chǎn)物的研究結(jié)果相一致,即較小分子量的肽類具有較強的抗氧化潛能[20-21]。Pe?a-Ramo等研究也發(fā)現(xiàn),在常壓下WPI經(jīng)Alcalase水解后,其產(chǎn)物中低分子肽類具有較強的脂質(zhì)過氧化抑制作用[3]。因此,蛋白水解反應(yīng)所生成的水解產(chǎn)物中的肽段的類型可能是影響其抗氧化活性強弱的重要因素之一。

        圖3 400MPa高壓處理中WPI水解產(chǎn)物不同組分對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.3 The superoxide anion radical scavenging ability of different component of WPI hydrolysates by using 400MPa high pressure treatment

        3 結(jié)論

        超高壓與Alcalase協(xié)同作用顯著地促進了WPI的水解,其水解產(chǎn)物對超氧陰離子自由基的清除能力也顯著提高。在400MPa的高壓處理中生成的WPI水解產(chǎn)物具有最強的超氧陰離子自由基清除能力,其半抑制濃度IC50值最小為582.15μg/mL。進一步分離純化出的低分子量肽類(Mw<3ku)對WPI水解產(chǎn)物的抗氧化能力起著重要的作用。因此,超高壓下的WPI水解產(chǎn)物可作為天然食品添加劑用于提高功能性食品的抗氧化性能和抑制食品工業(yè)中氧化反應(yīng)的發(fā)生。

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        Preparation of bovine whey protein antioxidant peptides using combined high pressure treatment and Alcalase digestion

        SHENG Xiao-bo,MU Tai-hua*
        (Institute of Agro-Food Science and Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)

        To study the preparation of whey protein antioxidant peptides from whey protein isolate by the combination of high pressure treatment and Alcalase digestion,the proteolysis of WPI was conducted with Alcalase during or after the treatment at 100~600MPa.Pyrogallol autoxidation method was used to assess the superoxide anion radical scavenging ability.The results showed that the degree of hydrolysis for WPI was significantly enhanced by high pressure treatment,as well as the antioxidant activity of the hydrolysates.In addition,the fraction of molecular weight below 3ku had a maximum superoxide anion radical scavenging ability,with the half maximal inhibitory concentration(IC50)of 411.62μg/mL.Therefore,the combination of high pressure treatment and Alcalase digestion could be used to develop new natural antioxidants.

        high pressure;Alcalase;combination;antioxidant peptides;half maximal inhibitory concentration

        TS201.2+1

        B

        1002-0306(2012)01-0258-04

        2011-01-24 *通訊聯(lián)系人

        盛小波(1986-),男,在讀碩士研究生,研究方向:食品化學與營養(yǎng)。

        河北省山區(qū)百萬畝旱地雜糧技術(shù)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化示范(08230907Z-2);中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資助項目。

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