許 娜,劉青梅,楊性民
(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306;2.浙江萬(wàn)里學(xué)院寧波市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波315100)
響應(yīng)面法優(yōu)化鼠李糖乳桿菌凍干保護(hù)劑配方的研究
許 娜1,2,劉青梅2,*,楊性民2
(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306;2.浙江萬(wàn)里學(xué)院寧波市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波315100)
直投式乳酸菌發(fā)酵劑的制備中,菌體在冷凍干燥過(guò)程中受損會(huì)降低發(fā)酵活力。采用響應(yīng)面法結(jié)合Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與最陡爬坡法,探討保護(hù)劑對(duì)鼠李糖乳桿菌的保護(hù)效果。結(jié)果表明:脫脂乳、海藻糖和甘油對(duì)菌體存活率的影響比較顯著,脫脂乳與海藻糖、海藻糖與甘油對(duì)菌體存活率的交互作用影響高度顯著,而脫脂乳與甘油的交互作用不顯著。凍干保護(hù)劑最佳配方為:脫脂乳濃度6.56g/100mL、海藻糖濃度2.35g/100mL、甘油濃度2.47g/100mL,在此條件下,菌體存活率可達(dá)86.69%,該配方有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
鼠李糖乳桿菌,響應(yīng)面法,凍干保護(hù)劑,菌體存活率,最優(yōu)配方
鼠李糖乳桿菌是重要的發(fā)酵食品工業(yè)生產(chǎn)用菌,特別是在發(fā)酵酸菜等制品的加工過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。直投式發(fā)酵劑是一種不需經(jīng)過(guò)活化和擴(kuò)增便能直接應(yīng)用于生產(chǎn)的發(fā)酵劑,具有保藏周期長(zhǎng)、活菌含量高和質(zhì)量穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[1],能夠顯著提高發(fā)酵食品工業(yè)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量[2]。乳酸菌發(fā)酵劑的制備通常采用真空冷凍干燥技術(shù),在冷凍干燥過(guò)程中,必然會(huì)使部分菌體細(xì)胞受損傷、死亡及某些蛋白酶分子鈍化[3],使發(fā)酵活力下降。凍干保護(hù)劑的添加可以有效地減少乳酸菌在冷凍干燥過(guò)程中造成的傷害,在直投式發(fā)酵劑制備的生產(chǎn)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)上起著核心的重要作用[4-5]。本研究根據(jù)前人經(jīng)驗(yàn),選取8種公認(rèn)的保護(hù)效果較好的凍干保護(hù)劑[6-8]作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,結(jié)合Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與最陡爬坡法,首先確定影響顯著因素和最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域,然后建立數(shù)學(xué)模型尋找最優(yōu)組合,對(duì)保護(hù)劑配方進(jìn)行篩選和優(yōu)化,目標(biāo)是最大限度地提高菌體存活率,期望得出鼠李糖乳桿菌開發(fā)成為直投式商品發(fā)酵劑的最優(yōu)配方。
表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Plackett-Burman experimental design and corresponding response of cell survival rate
鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus) 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心,編號(hào)CICC6001;MRS肉湯培養(yǎng)基(用于菌種的傳代、擴(kuò)培和種子液制備)、MRS瓊脂培養(yǎng)基(用于菌落計(jì)數(shù)) 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;脫脂乳粉 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司;谷氨酸鈉、海藻糖、山梨醇、甘露醇、甘油、VC、硫酸錳 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為分析純。
YXQ-75SII立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;QT-2旋渦混合器 上海琪特分析儀器有限公司;SIGMA 6-16K型高速冷凍離心機(jī)、ALPHA 1-2型真空冷凍干燥儀 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司;Formascientific-725超低溫冰箱 美國(guó)Forma scientific公司;RZX智能型恒溫培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠。
1.2.1 活菌體的富集與培養(yǎng) 將保藏的菌種經(jīng)活化(10%脫脂乳粉)、傳代與擴(kuò)培,制成種子液,將制備的種子液接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中制備發(fā)酵液,接種量均為5%。采用搖瓶培養(yǎng),37℃、120r/min,添加0.5%K2HPO4作為緩沖液,調(diào)整pH在5.2左右,培養(yǎng)18h。1.2.2 菌懸液的制備 將發(fā)酵液移入已滅菌的離心管中,高速冷凍離心4000r/min,4℃,20min,棄上清液,用無(wú)菌水洗滌菌體,再以同樣的條件離心,收集菌體并用無(wú)菌水調(diào)菌濃度至1010cfu/mL。
1.2.3 凍干保護(hù)劑的制備 依照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),稱取相應(yīng)克數(shù)的保護(hù)劑,紫外殺菌30min,溶解于10mL無(wú)菌水中備用。
1.2.4 真空冷凍干燥條件 無(wú)菌條件下將保護(hù)劑與菌懸液混勻,-40℃冰箱中預(yù)凍2h,迅速轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥儀,-60℃,0.011mbar,干燥24h。
1.2.5 活菌體存活率計(jì)算 取凍干菌粉,加入與凍干前菌懸液同等體積的10%脫脂乳,復(fù)水活化30min,根據(jù)GB4789.2-2010,采用梯度稀釋平板活菌計(jì)數(shù)法,置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48~72h。
1.2.6 凍干保護(hù)劑優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以真空冷凍干燥后菌體存活率為響應(yīng)目標(biāo):首先利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)法在眾多因素中篩選出具顯著影響作用的幾種因素;然后通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn),研究最大響應(yīng)目標(biāo)的響應(yīng)區(qū)域;再利用Design Expert 7.0軟件,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),最終確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),并進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。
Plackett-Burman是一種基于不完整平衡塊為原理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,它能夠以較少實(shí)驗(yàn)次數(shù)準(zhǔn)確而有效地篩選出最為重要的幾個(gè)影響因素,供進(jìn)一步詳細(xì)的研究[9]。采用Minitab16.1軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析,選擇次數(shù)為N=12的實(shí)驗(yàn),針對(duì)8個(gè)因素進(jìn)行研究,每種因素分別取-1、+1兩個(gè)水平,響應(yīng)值為凍干后菌體存活率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1,各因素的效應(yīng)評(píng)價(jià)見表2。
表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素的效應(yīng)評(píng)價(jià)Table 2 Estimated effects of Plackett-Burman design
由表1、表2可以看出,脫脂乳、海藻糖和甘油這3個(gè)因素對(duì)菌體存活率的影響比較顯著,其中海藻糖影響最顯著,其次是甘油與脫脂乳,其他因素影響均不顯著。脫脂乳和海藻糖的t值為負(fù),說(shuō)明對(duì)響應(yīng)值的影響具有顯著性負(fù)效應(yīng),添加濃度應(yīng)相應(yīng)地減??;甘油的t值為正,說(shuō)明對(duì)響應(yīng)值的影響具有顯著性正效應(yīng),添加濃度應(yīng)相應(yīng)地增加。
通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果,篩選出了對(duì)菌體存活率具有顯著性影響作用的三個(gè)因素,即脫脂乳、海藻糖和甘油,并且分析出了爬坡方向,便于實(shí)驗(yàn)確定各因素合理的水平,以逼近最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域,進(jìn)一步靠近最優(yōu)點(diǎn)。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。
表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design of steepest ascent and corresponding results
由表3可見,通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定了最大響應(yīng)值的響應(yīng)區(qū)域,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以表3中4號(hào)實(shí)驗(yàn)為中心點(diǎn),進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸方程方差分析 以菌體存活率Y為響應(yīng)值,采用Design-Expert7.0軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),根據(jù)得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立二次響應(yīng)面回歸模型,以尋求最優(yōu)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)選用三因素三水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn),其中析因部分實(shí)驗(yàn)次數(shù)為12次,中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)次數(shù)為3次,用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表4,優(yōu)化設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表5。
表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素及水平Table 4 Variables and levels in Box-Behnken design
表5 Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 5 Box-Behnken design and corresponding results
采用Design-Expert7.0軟件對(duì)表5的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析,編碼值X1、X2、X3分別代表脫脂乳、海藻糖和甘油,回歸方程的方差分析結(jié)果如表6所示。
表6 回歸方程方差分析表Table 6 Analysis of variance for regression equation
由表6回歸方程的方差分析可知,回歸方程失擬項(xiàng)不顯著(P=0.0645)且數(shù)值較小,說(shuō)明數(shù)據(jù)擬合效果較好,實(shí)驗(yàn)誤差小。對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合,得到的二次回歸擬合多項(xiàng)式方程為:
Y=86.37+0.69X1+3.63X2+0.91X3+1.80X1X2-0.12X1X3+1.18X2X3-1.78X12-4.49X22-1.41X32。
相關(guān)系數(shù)R2=99.43%,P<0.0001,說(shuō)明方程擬合非常好,有實(shí)際的應(yīng)用意義?;貧w方程模型的F檢驗(yàn)極度顯著,說(shuō)明擬合的多項(xiàng)式方程非常合適,能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)實(shí)際情況;一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的F檢驗(yàn)顯著,說(shuō)明所選擇的脫脂乳、海藻糖和甘油三種因素對(duì)菌體存活率的影響都很顯著,其中海藻糖極度顯著,其次是甘油和脫脂乳;由交互項(xiàng)的F檢驗(yàn)可知,脫脂乳與海藻糖、海藻糖與甘油對(duì)菌體存活率影響的交互作用高度顯著,而脫脂乳與甘油的交互作用不顯著。
圖1 脫脂乳和海藻糖交互作用對(duì)菌體存活率影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface of interactive effects for skimmed milk and trehalose on cell survival rate
2.3.2 響應(yīng)面圖及等高線圖分析 采用Design-Expert7.0軟件設(shè)計(jì)得出的響應(yīng)面圖和等高線圖,可以直觀地反映各因素對(duì)響應(yīng)值的影響,以及在反應(yīng)過(guò)程中的交互作用影響。在等高線圖中,橢圓型或者馬鞍型的等高線表示因素之間交互作用顯著,而圓型的等高線表示因素之間交互作用較弱。
由圖1可以看出,等高線呈橢圓形,說(shuō)明脫脂乳和海藻糖交互作用非常顯著。當(dāng)甘油濃度在2.6g/ 100mL,脫脂乳濃度范圍在6.16~7.00g/100mL范圍內(nèi),海藻糖濃度在2.34~2.70g/100mL范圍內(nèi),可獲得高于85.41%的菌體存活率。
圖2 脫脂乳和甘油交互作用對(duì)菌體存活率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface of interactive effects for skimmed milk and glycerol on cell survival rate
由圖2可見,等高線呈圓型,說(shuō)明脫脂乳與甘油交互作用不顯著,當(dāng)海藻糖濃度在2.40g/100mL時(shí),脫脂乳濃度范圍在6.25~6.95g/100mL,甘油濃度范圍在2.51~2.80g/100mL,可獲得高于85.72%的菌體存活率。
圖3 海藻糖和甘油交互作用對(duì)菌體存活率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface of interactive effects for trehalose and glycerol on cell survival rate
圖3顯示海藻糖和甘油交互作用顯著,當(dāng)脫脂乳濃度為6.5g/100mL,海藻糖濃度在2.34~2.7g/100mL范圍內(nèi),甘油濃度在2.47~2.80g/100mL濃度范圍內(nèi),可獲得高于85.64%的菌體存活率。
2.3.3 結(jié)果驗(yàn)證 采用Design-Expert7.0軟件,以求得最大菌體存活率為目標(biāo),在所得到的30種配方組合中分析篩選出最佳濃度配比為:脫脂乳濃度為6.56g/100mL、海藻糖濃度為2.35g/100mL、甘油濃度為2.47g/100mL,在此基礎(chǔ)上得到菌體存活率的理論預(yù)測(cè)值為87.49%。以篩選出的最佳濃度配比進(jìn)行9組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),平均菌體存活率值為86.69%,實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相吻合,說(shuō)明響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可靠。
由回歸方程的方差分析得出:回歸方程失擬項(xiàng)不顯著(P=0.0645),相關(guān)系數(shù)R2=99.43%,P<0.0001,說(shuō)明回歸方程擬合非常好,建立的數(shù)學(xué)模型有實(shí)際的應(yīng)用意義;回歸方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)F檢驗(yàn)表明脫脂乳、海藻糖和甘油對(duì)菌體存活率的影響均比較顯著,說(shuō)明篩選的因素對(duì)凍干過(guò)程中鼠李糖乳桿菌的菌體細(xì)胞有顯著保護(hù)作用;由響應(yīng)面圖和等高線圖以及回歸方程交互項(xiàng)的F檢驗(yàn)可知:脫脂乳與海藻糖、海藻糖與甘油對(duì)菌體存活率影響的交互作用高度顯著,脫脂乳與甘油的交互作用不顯著。響應(yīng)面分析法得到的凍干保護(hù)劑最佳配方為:脫脂乳濃度6.56g/100mL、海藻糖濃度2.35g/100mL、甘油濃度2.47g/100mL,在此條件下,菌體存活率值為86.69%,該配方有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
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Study on optimization formula of cryoprotectants for Lactobacillus rhamnosus by response surface methodology
XU Na1,2,LIU Qing-mei2,*,YANG Xing-min2
(1.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;2.Key Lab of Agricultural Processing Technology of Ningbo,Zhejiang Wanli University,Ningbo 315100,China)
In the processing of lyophilization for the directed vat set starter cultures of lactic acid bacteria,the total amount of cell population and fermentative activity was reduced.The optimization formulation of cryoprotectants for Lactobacillus rhamnosus was optimized with the way of response surface methodology which joined by Plackett-Burman design and the steepest ascend method.The results indicated that:The skimmed milk,trehalose and glycerol all significantly affected the survival rate of the Lactobacillus rhamnosus. The interaction between skimmed milk and trehalose was remarkable,so as the reaction of trehalose and glycerol,but the interaction between skimmed and glycerol.The research concluded the optimum of cryoprotectants as follows:The skimmed milk 6.56g/100mL,trehalose 2.35g/100mL,glycerol 2.47g/100mL.By using this process,the optimal cell survival rate was observed to be 86.69%,which was closed to the theory model and had the features of practicability.
Lactobacillus rhamnosus;response surface methodology;cryoprotectants;survival rate;optimization formula
TS201.1
B
1002-0306(2012)01-0207-04
2011-09-08 *通訊聯(lián)系人
許娜(1986-),女,碩士在讀,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品加工。
國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2010GA01009);寧波市招標(biāo)項(xiàng)目(2010C100017)。