趙偉華，程建軍，楊秋萍，任為聰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

高溫變性豆粕發(fā)酵菌株的選育

趙偉華，程建軍*，楊秋萍，任為聰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030）

以米曲霉CICC40186為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變處理后，獲得對高溫變性豆粕分解能力強的突變菌株8421和8422。與出發(fā)菌株相比，兩突變株所產(chǎn)酸性、中性和堿性三種蛋白酶分別提高了73.2%、91.2%，81.1%、83.7%，37.6%、32.9%；三氯乙酸（TCA）可溶性蛋白含量分別提高了約13.0%和13.2%。經(jīng)6次傳代，遺傳性狀穩(wěn)定。

米曲霉，紫外誘變，蛋白酶，TCA可溶性蛋白

米曲霉（Aspergillus oryzae）由于其酶系豐富，除產(chǎn)蛋白酶外，還可產(chǎn)淀粉酶、糖化酶、纖維素酶、植酸酶等，因而受到人們的廣泛關(guān)注。在蛋白酶的作用下，可以將不易消化的大分子蛋白質(zhì)降解為蛋白胨、多肽及各種氨基酸，而且可以使輔料中粗纖維、植酸等難吸收的物質(zhì)降解，提高營養(yǎng)價值、保健功效和消化率，廣泛應(yīng)用于食品、飼料、生產(chǎn)曲酸、釀酒等發(fā)酵工業(yè)，并已被安全地應(yīng)用了1000多年。2005年，國外學(xué)者完成了對米曲霉基因組的破譯[1]。米曲霉中由于沒有產(chǎn)黃曲霉毒素的完整基因組，進一步證明了米曲霉在發(fā)酵工業(yè)中的安全性[2]。國內(nèi)對于米曲霉的研究主要集中在如何利用米曲霉提高食品釀造業(yè)的生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量上。發(fā)酵菌種的特性決定了生產(chǎn)的工藝，所以近年來人們不斷通過各種誘變手段獲得新的菌株。如采用NTG和UV復(fù)合誘變，選育出一株中性蛋白酶活力高、生長快、對米渣分解能力強的優(yōu)良菌株，中性蛋白酶活力較原菌株提高了32.6%，使得用米渣制成含有多種氨基酸的蛋白質(zhì)水解液成為可能[3]。利用N+注入法進行誘變，突變株TK-7DE的蛋白酶活力較原菌株提高了36%[4]。紫外線誘變由于其誘變頻率高，不易回復(fù)突變，所以一直在工業(yè)微生物育種史上發(fā)揮著極其重要的作用。利用紫外線對野生米曲霉進行誘變選育，蛋白酶活力得到大幅度提高，用其發(fā)酵制醬，與工業(yè)上普遍應(yīng)用的米曲霉滬釀3.042做比較，氨基酸態(tài)氮有所提高，差異性顯著[5]。周其洋對米曲霉1-7.3進行紫外誘變，所得菌株酸性蛋白酶和中性蛋白酶分別比出發(fā)菌株提高了230.10%和17.5%[6]。但是國內(nèi)利用米曲霉在制醬及醬油中多是采用豆餅或者低溫變性豆粕為底物。高溫變性豆粕是大豆煉油后的副產(chǎn)物，煉油工藝中高溫脫溶步驟造成蛋白質(zhì)的熱變性，導(dǎo)致了高溫變性豆粕的蛋白質(zhì)溶解性較差，蛋白利用率低。而由于米曲霉的酶系作用，對底物作用的活力位點不同[7]，因此通過誘變選出對高溫變性豆粕分解能力強的菌株有利于高溫變性豆粕的開發(fā)與利用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

米曲霉CICC40186 中國工業(yè)微生物菌種保藏中心；高溫變性豆粕 黑龍江省雙鴨山市楊霖油脂廠；PDA培養(yǎng)基 馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂粉20g/L；初篩培養(yǎng)基 干酪素4g/L，KH2PO40.36g/L，Na2HPO41.07g/L，CaCl20.002g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，瓊脂20g/L，pH6.5～7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基 高溫變性豆粕16g，葡萄糖4g，水200mL，裝入500mL三角瓶中。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變實驗

1.2.1.1 紫外誘變 將紫外線燈打開穩(wěn)定約20min，取調(diào)整好孢子濃度的孢子懸液10mL置于無菌的培養(yǎng)皿中。再將上述培養(yǎng)皿置于磁力攪拌器上，打開皿蓋，距離紫外線燈下30cm分別照射2、4、6、8、10min。取經(jīng)紫外線輻射的孢子懸液1mL，加入到裝有9mL生理鹽水的無菌試管中，按梯度（102～l06）逐一稀釋。每個稀釋度取孢子懸液0.1mL進行平板涂布，重復(fù)3～5次。30℃下于恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)1d后，光照培養(yǎng)。同樣方法，取未經(jīng)紫外線處理的孢子懸液稀釋涂布作為對照，確定最佳紫外照射時間，并計算出相應(yīng)的致死率和正突變率。

1.2.1.2 初篩 將最佳紫外照射時間的菌株在初篩培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在3、4、5d時測量菌株的水解圈和菌落直徑。計算R值。選擇R值大于出發(fā)菌株的菌落作為目標(biāo)菌株，轉(zhuǎn)接到PDA斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)保藏備用，并確定最佳培養(yǎng)時間即復(fù)篩時間。

1.2.1.3 復(fù)篩 將培養(yǎng)4d的PDA斜面加入5mL無菌水，振蕩30s，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整孢子濃度為106個/mL，按10%（v/v）的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃，160r/min搖床振蕩培養(yǎng)4d，以蛋白酶活和TCA可溶性蛋白含量為檢測指標(biāo)進行復(fù)篩。

1.2.1.4 遺傳穩(wěn)定性測定 選出蛋白酶活力和TCA可溶性蛋白含量高的菌株做遺傳穩(wěn)定性實驗，觀察其遺傳穩(wěn)定性。傳代的菌株同樣制備種子液，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，測定酶活和TCA可溶性蛋白含量。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 蛋白酶活力的測定 采用SB/T 10317-1999，F(xiàn)olin-酚法進行測定。

1.2.2.2 TCA可溶性蛋白含量的測定 參照文獻[2]，略加修改。將等體積的TCA（0.4mol/L）加入到發(fā)酵液中，靜置0.5h，后以4000r/min離心20min，去除沉淀，凱氏定氮法測定上清液中的蛋白含量。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 本實驗利用EXCEL2003進行數(shù)據(jù)分析。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件中的方差分析進行單因素方差分析，并用Duncan檢驗法做多重比較，進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外照射時間對致死率和正突變率的影響

由圖1可知，隨著紫外照射時間的延長，致死率呈現(xiàn)出正相關(guān)性。在10min的時候達到100%。正突變率則先隨時間增長而增大，于4min時達到最大，為22.99%，之后呈現(xiàn)出下降趨勢。8min時，正突變率為19.54%，雖然此時菌株正突變率數(shù)量小于4min時，但8min時正突變菌株R值增大效果普遍大于4min時的R值增大效果，正突變率效果好。所以本實驗選取8min為最佳誘變時間。此時，致死率達到85.8%。

圖1 誘變時間與致死率和正突變率之間的關(guān)系Fig.1 Effect on proportion of deadly and mutation with UV

2.2 紫外誘變的初篩

表1 菌株初篩結(jié)果（mm）Table 1 Prescreening result of strains（mm）

由表1可知，所選菌株與原菌株比較，R值均有所增大，全部確定為復(fù)篩菌株。菌株的直徑和水解圈的直徑隨著時間而逐漸增大，R值在第3d到第4d期間有所增長，第5d變化不大，甚至呈現(xiàn)減小趨勢。說明米曲霉所產(chǎn)的蛋白酶在第4d時達到最大。第5d時，米曲霉已進入衰亡期，菌株在生長，但產(chǎn)酶能力已經(jīng)下降，所以確定復(fù)篩的時間為4d。

但有的學(xué)者認(rèn)為水解圈大的菌株酶活不一定高[8-9]，本研究為了驗證酶活和水解圈的關(guān)系，以R值為橫坐標(biāo)，酶活為縱坐標(biāo)作圖，采用一元線性回歸進行分析，結(jié)果見圖2和表2。

從圖2中可以看出，R值在1.24到1.65之間，三種蛋白酶活與R值在總體上存在著一定的線性關(guān)系。由表2可知，酸性蛋白酶與中性和堿性蛋白酶相比較，相關(guān)系數(shù)較大，為0.9289。說明R值與酸性蛋白酶之間存在著較好的線性關(guān)系。中性蛋白酶和堿性蛋白酶相關(guān)系數(shù)小于酸性蛋白酶，分別為0.8308和0.8055，存在一定的相關(guān)性。雖然相關(guān)性不是極顯著，但可以在一定程度上反映出R值越大，酶活越高。且三種蛋白酶均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（plt;0.05）。所以，為了大量減少勞動量，可以認(rèn)為水解圈與菌株直徑的比值能夠作為產(chǎn)酶能力大小的指標(biāo)進行初篩，這與劉軍[10]的報道一致。

圖2 R值與酶活和TCA可溶性蛋白含量的相關(guān)性分析Fig.2 The correlation of R with enzyme activity and TCA soluble protein content

表2 相關(guān)性分析結(jié)果Table 2 The results of correlation analysis

2.3 紫外誘變的復(fù)篩

利用發(fā)酵培養(yǎng)基進行液態(tài)發(fā)酵，測定各菌株蛋白酶活力和TCA可溶性蛋白含量，結(jié)果見表3。

表3 各菌株蛋白酶活力和TCA可溶性蛋白含量比較Table 3 Contrast of different strains'activity of protease and TCA soluble protein

由表3可知，誘變得到的8株米曲霉在三種蛋白酶活及TCA可溶性蛋白含量方面與原菌株相比，均有較大程度的提高，且米曲霉8421和8422提高程度尤為顯著。兩菌株所產(chǎn)蛋白酶中酸性、中性、堿性蛋白酶分別提高了73.2%，91.2%；81.1%，83.7%；37.6%，32.9%；TCA可溶性蛋白含量分別提高了約13.0%和13.2%；與原菌株相比均具有顯著性差異。

2.4 遺傳穩(wěn)定性的測定

將米曲霉8421和8422傳代6次并發(fā)酵后測定其總蛋白酶活和TCA可溶性蛋白含量，結(jié)果見圖3。

由圖3中可以看出，菌株編號8421和8422經(jīng)過6次傳代實驗后，酶活和TCA可溶性蛋白含量均處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，可見誘變后兩菌株遺傳穩(wěn)定性較好。

圖3 菌株各代遺傳穩(wěn)定性Fig.3 Stability study of the mutagenic strain

3 結(jié)論

通過對米曲霉CICC40186進行紫外誘變選育，誘變時間為8min，經(jīng)過初篩和復(fù)篩選育出兩株所產(chǎn)蛋白酶活力高，對高溫變性豆粕分解能力強的菌株，編號8421、8422，兩菌株所產(chǎn)蛋白酶中酸性、中性、堿性蛋白酶較原菌株比較均有較大提高，且通過發(fā)酵，使高溫變性豆粕中TCA可溶性蛋白含量分別提高了約13.0%和13.2%，兩菌株遺傳性狀穩(wěn)定。

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Screening of Aspergillus oryzae for highly denatured defatted soy flakes fermentation

ZHAO Wei-hua，CHENG Jian-jun*，YANG Qiu-ping，REN Wei-cong
（Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

The Aspergillus oryzae CICC40186 was mutagenized by the ultraviolet radiation.Based on the activity of three proteases and the content of Trichloroacetic acid（TCA）soluble protein，Aspergillus oryzae 8421 and 8422 were screened.Compared with the original strains，the acid protease，neutral protease，and alkaline protease of the mutant strains were increased by 73.2%and 91.2%；81.1%and 83.7%；37.6%and 32.9% respectively.The content of the TCA soluble protein was increased by 13.0%and 13.2%respectively.The heredity was stable after 6 generation.

Aspergillus oryzae；ultraviolet mutation；protease；TCA soluble protein

TS201.3

A

1002-0306（2012）01-0186-03

2010－11－15 *通訊聯(lián)系人

趙偉華（1985-），男，研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與儲藏。

黑龍江省科技計劃項目任務(wù)書（GB08B401-02）。