張燕鵬，楊瑞金，王 賀，蔣孝燕

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

傳統(tǒng)豆渣菌的菌相分析及蛋白酶和纖維素酶主要產(chǎn)生菌株的鑒定

張燕鵬1，楊瑞金2，*，王 賀1，蔣孝燕1

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

對(duì)江西瑞金的特色發(fā)酵食品-豆渣菌進(jìn)行了菌相分析，結(jié)果表明豆渣菌是以真菌和細(xì)菌為主的混合型發(fā)酵食品。真菌主要為串珠霉屬（Monilia）、根霉屬（Rhizopus）和酵母屬（Saccharomyces）；細(xì)菌主要為微球菌屬（Micrococcus）葡萄球菌屬（Staphylococcus）、片球菌屬（Pediococcus）、異常球菌屬（Deinococcus）、腸桿菌屬（Enterobacterspp），非乳桿菌屬和三株枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。串珠霉屬真菌具有纖維素酶和蛋白酶活力，枯草芽孢桿菌和根霉屬真菌則具有蛋白酶活力。

豆渣菌，菌相分析，纖維素酶，蛋白酶

豆渣是豆制品加工過程中主要的副產(chǎn)品，通常含有約50%的纖維、20%的蛋白質(zhì)和10%的油脂[1]。C. Y.Ma，W.S等的研究結(jié)果表明，豆渣中的蛋白質(zhì)含有豐富的必需氨基酸，并且具有較高的體外消化率[2]；豆渣中的膳食纖維可以有效清除人體內(nèi)的脂肪[3-4]。然而，由于豆渣纖維素含量較高，口感較差，所以目前豆渣的利用率較低，主要是將豆渣作為動(dòng)物飼料直接喂養(yǎng)動(dòng)物。在江西瑞金等地有一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品——“豆渣菌”，是以新鮮豆渣為原料通過傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)制備而成，具有很好的鮮味和口感，往往被作為湯料或者直接烹飪，已經(jīng)成為當(dāng)?shù)氐囊环N傳統(tǒng)美食。國(guó)內(nèi)的余永紅、鄧澤元[5]等人從傳統(tǒng)“豆渣菌”中分離出了產(chǎn)纖維素酶的菌株，但對(duì)于“豆渣菌”的具體菌相分析未見報(bào)道。本文的目的是通過對(duì)傳統(tǒng)“豆渣菌”微生物菌相的系統(tǒng)分析，特別是產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶主要菌株的鑒定，為改進(jìn)“豆渣菌”傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

豆渣菌 購于江西瑞金農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；大豆?jié)饪s蛋白培養(yǎng)基（g/L） 蛋白胨0.5，酵母膏0.3，大豆?jié)饪s蛋白10.0，瓊脂15，pH7.0；纖維素培養(yǎng)基（g/L） 羧甲基纖維素鈉20，蛋白胨5，酵母膏0.5，脫氧膽酸鈉0.5，瓊脂15，pH5.0；豆?jié){試管培養(yǎng)基 15mm×150mm試管中裝豆?jié){60mm，pH自然。

1.2 豆渣菌的菌相分析

1.2.1 樣品的處理 從不同部位共取樣品25g，在無菌條件下研磨，然后放入225mL帶玻璃珠的無菌稀釋液中（含0.1%蛋白胨和0.85%氯化鈉），振蕩20min后制備成樣品均液備用。

1.2.2 微生物分離純化 樣品均液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取0.1mL進(jìn)行涂平板。細(xì)菌分離采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置于37℃下培養(yǎng)24h，霉菌和酵母菌分離采用馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基，置于28℃下培養(yǎng)24～72h。微生物長(zhǎng)出單菌落后再反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離以得到純株。

表1 豆渣菌分離的細(xì)菌形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of bacteria from Douzhajun

1.2.3 優(yōu)勢(shì)菌群的鑒定

1.2.3.1 細(xì)菌鑒定 參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[6]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，芽孢桿菌結(jié)合16S rRNA進(jìn)行鑒定。

1.2.3.2 真菌鑒定 對(duì)真菌進(jìn)行載片培養(yǎng)[10]和點(diǎn)植法觀察，并參考《常見與常用真菌》[8]和《真菌鑒定手冊(cè)》[9]進(jìn)行鑒定。

1.2.3.3 酵母鑒定 觀察酵母菌的菌落和菌體形態(tài)，并參考《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[11]進(jìn)行鑒定。

1.3 芽孢桿菌的16S rRNA鑒定

使用試劑盒提取芽孢桿菌總DNA，采用通用引物F（5’-AG AG TTTG ATCCTG G CTCAG-3’）及R（5’-TACG G CTAC CTTG TTACG ACTT-3’）利用PCR擴(kuò)增供試菌株的16S rDNA片段。用標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25μL：10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl21.5μL，dNTP（2.5mmol/L）2.0μL，引物F（20μmol/L）0.5μL，引物R（12μmol/L）0.5μL，TapDNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，細(xì)菌總DNA稀釋適當(dāng)倍數(shù)（×50）0.5μL，ddH2O 17.25μL。循環(huán)條件：94℃，4min；94℃，1min；55℃退火1min；72℃延伸2min；35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，VDS成像檢測(cè)。在紫外燈下切下目的DNA，使用試劑盒回收目的DNA，純化的DNA產(chǎn)物連入PGM-T載體，轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子在含X-gal和氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，然后提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。所測(cè)定得到的16S rDNA序列輸入GenBank，用Blast軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并申請(qǐng)獲得GenBank的登錄號(hào)。

1.4 蛋白酶產(chǎn)生菌的確定

把挑選到的優(yōu)勢(shì)菌株分別點(diǎn)接到大豆?jié)饪s蛋白培養(yǎng)基上，放置適宜培養(yǎng)溫度下培養(yǎng)3d，每個(gè)菌株做2次重復(fù)，通過計(jì)算蛋白質(zhì)降解的透明圈與菌落直徑的比值，來判定產(chǎn)蛋白酶的活力。

1.5 纖維素酶產(chǎn)生菌的確定

把挑選到的優(yōu)勢(shì)菌株點(diǎn)接到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，放在適宜的溫度下培養(yǎng)3d，向培養(yǎng)基中加入適量的1mg/mL剛果紅溶液，染色1h，棄去染液后，加入適量1mol/L的NaCl溶液，洗滌1h，通過觀察菌落周圍清晰的透明圈來判定產(chǎn)纖維素酶的活力[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌菌落特征的觀察

表2 球菌生理生化實(shí)驗(yàn)Table 2 Physiological and biochemical experiment of Cocci

表3 革蘭氏陰性桿菌的生理生化實(shí)驗(yàn)Table 3 Physiological and biochemical experiment of Gram-negative bacilli

細(xì)菌經(jīng)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上分離培養(yǎng)后通過菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察，其形態(tài)特征如表1所示。從表1可以看出，分離的菌株中有3株為芽孢桿菌，5株為球菌，2株為革蘭氏陰性桿菌，5株為無芽孢的革蘭氏陽性桿菌。進(jìn)一步對(duì)不同細(xì)菌做生理生化實(shí)驗(yàn)，如表2～表4所示。通過生理生化實(shí)驗(yàn)，參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步鑒定B1為微球菌屬（Micrococcus）；B2為葡萄球菌屬（Staphylococcus）；B6為片球菌屬（Pediococcus）；B8和B10為異常球菌屬（Deinococcus）；B3、B5屬于腸桿菌屬（Enterobacterspp）；B4、B7、B9、B11、B12為非乳桿菌屬，在《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中歸為位置不確定的屬。

表4 無芽孢的革蘭氏陽性桿菌的生理生化實(shí)驗(yàn)Table 4 Physiological and biochemical experiment of Gram-positive asporogenous bacilli

表5 霉菌菌落和形態(tài)特征Table 5 Colonial and morphological characteristics of fungi

2.2 芽孢桿菌的16S rRNA鑒定

PB13、PB14、PB15經(jīng)過細(xì)胞觀察可以初步確定為芽孢桿菌屬，再通過16S rRNA對(duì)這三株芽孢桿菌進(jìn)一步鑒定。經(jīng)序列測(cè)定，確定這三株芽孢桿菌的擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為1515、1513、1514bp，序列提交GenBank獲得的登錄號(hào)分別為：HM047561、HM047563、HM047562。經(jīng)核酸同源性分析，這三株菌都與枯草芽孢桿菌的同源性達(dá)到99%以上，可以確定這三株細(xì)菌都屬于枯草芽孢桿菌（Bacillus.subtilis）。

2.3 霉菌菌落觀察和鑒定

分離的2株霉菌的菌落和菌體形態(tài)及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)如表5所示。通過對(duì)菌落和菌體形態(tài)及菌絲產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的觀察，并參考《常見與常用真菌》和《真菌鑒定手冊(cè)》，可以鑒定F1為串珠霉屬（Monilia），F(xiàn)2為根霉屬（Rhizopus）。

2.4 酵母菌菌落形態(tài)和鑒定

對(duì)酵母菌Y1和Y2的菌落和菌體形態(tài)觀察如表6所示，通過參考《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》，可以鑒定Y1和Y2都屬于酵母屬（Saccharomyces）。

表6 酵母菌菌落和形態(tài)特征Table 6 Colonial and morphological characteristics of yeast

2.5 產(chǎn)蛋白酶和產(chǎn)纖維素酶菌株的確定

豆渣中含有20%左右的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)的降解對(duì)豆渣菌的鮮味、風(fēng)味和功能性質(zhì)起重要作用。為了更針對(duì)性地確定可以降解大豆蛋白的菌株，分別使用大豆?jié)饪s蛋白和豆?jié){為底物來篩選產(chǎn)蛋白酶的細(xì)菌和霉菌。另外豆渣中富含膳食纖維，約占豆渣干重的55%左右，但由于纖維素含量高、纖維顆粒大，其口感粗糙，將纖維素適當(dāng)降解，對(duì)提高可溶性膳食纖維和改善豆渣的口感都有重要的意義。因此，篩選出產(chǎn)蛋白酶和纖維素酶的菌株對(duì)豆渣菌發(fā)酵工藝的研究有著重要意義。表7表明，細(xì)菌中主要是三株枯草芽孢桿菌產(chǎn)生蛋白酶，其中枯草芽孢桿菌PB14的透明圈和菌落直徑比為2.43，PB13和PB15分別為2.09和2.11，說明枯草芽孢桿菌PB14具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶活力；通過接種豆?jié){培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)真菌F1和F2均具有蛋白酶活力，可以在5d內(nèi)降解大豆蛋白，使豆?jié){變得澄清。對(duì)于纖維素酶而言，發(fā)現(xiàn)僅霉菌F1可以明顯降解纖維素產(chǎn)生透明圈，其他菌株均不具有纖維素酶的活力。

表7 分離菌株的蛋白酶和纖維素酶活力Table 7 The proteolytic and cellulose activity of the strain

3 結(jié)論

菌系分析表明，豆渣菌主要是以霉菌中的串珠霉屬（Monilia）為主，還含有根霉屬（Rhizopus）和酵母屬（Saccharomyces）；細(xì)菌主要是桿菌和球菌，其中桿菌主要是枯草芽孢桿菌（Bacillus.subtilis）、腸桿菌屬（Enterobacterspp）、非乳桿菌屬；球菌含有葡萄球菌屬（Staphylococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和異常球菌屬（Deinococcus）。串珠霉屬霉菌主要產(chǎn)纖維素酶和蛋白酶，而枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、根霉屬（Rhizopus）霉菌主要產(chǎn)蛋白酶。這些菌有效地降解了豆渣中的纖維素和蛋白質(zhì)，使其可溶性膳食纖維增加。大分子的蛋白質(zhì)降解為肽類和氨基酸，從而有利于人體的吸收和利用，并對(duì)豆渣菌的口感及鮮味起一定的作用。而豆渣菌中的球菌和腸桿菌屬，非乳桿菌屬對(duì)風(fēng)味是否起作用，并且是否是有害菌有待進(jìn)一步的探討。

發(fā)現(xiàn)及發(fā)掘豆渣菌中的優(yōu)勢(shì)和有益菌種，并對(duì)其發(fā)酵特性進(jìn)行針對(duì)性的研究，可以更好地將其運(yùn)用到以后的豆渣發(fā)酵中，以便提供更為安全和美味的發(fā)酵產(chǎn)品，使豆渣菌這一具有地方特色的發(fā)酵食品得到更為廣泛的發(fā)展。

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Analysis of the microflora and identification of the protease and cellulase producing strains from the traditional fermentative Douzhajun

ZHANG Yan-peng1，YANG Rui-jin2，*，WANG He1，JIANG Xiao-yan1
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The microflora of Douzhajun，a traditional okara-fermented food，was analysed.The result indicated that Douzhajun was a food fermented mainly by fungi and bacteria.The fungi included the Monili.Rhizopu.and Saccharomyce，and the bacteria included Staphylococcus，Pediococcus，Deinococcus，Enterobacterspp，non-Lactobacillus and three strains of B.subtilis.Monilia.was able to secrete the cellulase and protease，the B. subtilis and Rhizopus were able to secrete the protease.

Douzhajun；analysis of microflora；cellulose；protease

TS201.2

A

1002-0306（2012）01-0171-04

2010－09－14 *通訊聯(lián)系人

張燕鵬（1980-），男，博士研究生，研究方向：植物蛋白工程。