閆永飛，石亞偉

（教育部化學(xué)生物學(xué)與分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

莜麥中病程相關(guān)蛋白的分離純化及其幾丁質(zhì)酶活性分析

閆永飛，石亞偉*

（教育部化學(xué)生物學(xué)與分子工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

病程相關(guān)蛋白廣泛存在于高等植物中，可以被多種微生物病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)生，是植物抗病物質(zhì)，具有重要應(yīng)用前景。以莜麥種子為原料，經(jīng)丙酮脫脂、硫酸銨鹽析、DEAE離子交換以及Superdex－200層析等方法，獲得一種具有幾丁質(zhì)酶活性的病程相關(guān)蛋白，其在酸性條件下穩(wěn)定存在，最適pH為5.0，最適反應(yīng)溫度為45℃，當(dāng)溫度高于65℃時(shí)活性喪失80%。蛋白分子量經(jīng)測(cè)定為23.7ku，為單體蛋白。該蛋白可以抑制白腐菌、毛殼菌的生長(zhǎng)，其最低抑制濃度為

30μg/mL；但對(duì)紅曲霉沒(méi)有效果。

病程相關(guān)蛋白，莜麥，純化，特征

Van Loon等1970年首先從煙草花葉病毒（tobaccomosaic virus，TMV）侵染的煙草葉片中檢測(cè)到與過(guò)敏性反應(yīng)（HR）相關(guān)的蛋白，如葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶，后來(lái)將這些由病原物誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的特異性蛋白質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為病程相關(guān)蛋白（pathogenesis－related proteins，PRP），它們屬于抗真菌蛋白的一種。至今已在7個(gè)科30多種植物中發(fā)現(xiàn)PRP，其中多數(shù)為雙子葉植物，例如番茄[1]、馬鈴薯[2]、菜豆、豌豆、豇豆[3－4]，最近又在野油菜[5]、蕓薹[6]、鷹嘴豆[7]、擬南芥[8]、水稻[9]中分離到病程相關(guān)蛋白。PRP在正常植物中不存在或表現(xiàn)微弱，而當(dāng)植物被病原菌感染或誘導(dǎo)后，則迅速產(chǎn)生并積累。與病原菌本身相關(guān)的一些物質(zhì)同樣可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生PRP，例如幾丁質(zhì)、β－1，3葡聚糖等[10]。PRP相對(duì)分子質(zhì)量較小，一般為10～40ku，PRP有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，大部分PRP能抵抗蛋白酶、糖苷酶、重金屬、尿素、低pH和高溫（60℃）。不同誘發(fā)因子在誘導(dǎo)植物系統(tǒng)中產(chǎn)生的PRP的生物特性各不相同。PRP一般表現(xiàn)一種或幾種活性，如幾丁質(zhì)酶、β－1，3葡聚糖酶、脫乙酰殼多糖酶、類(lèi)甜味蛋白（Thaumatin－Like protein，TLP）等。植物體的病程相關(guān)蛋白中TLP一類(lèi)屬于多功能蛋白，不僅具有α－淀粉酶的抑制活力，還有胰蛋白酶的抑制活力以及幾丁質(zhì)酶的部分活力[4]。本文從山西應(yīng)縣的莜麥種子中，利用蛋白的分離純化技術(shù)，獲得到一種病程相關(guān)蛋白，除具有抑制胰蛋白酶活力外，還具有抗真菌活性，并發(fā)現(xiàn)其具有一定的幾丁質(zhì)酶活性。在以膠體幾丁質(zhì)為底物的條件下，分析了該酶的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH以及金屬離子對(duì)該蛋白幾丁質(zhì)酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

莜麥種子 產(chǎn)自山西應(yīng)縣；蛋白分離純化的材料 DEAE－Sepharose Fast Flow柱、Superdex－200柱，均購(gòu)自GE公司；甲殼素 購(gòu)自中國(guó)生化制品廠；其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；抗真菌活性測(cè)定所用的白腐菌（Trametes sp.SQ01）、毛殼菌（Chaetomium sp.R01）、紅曲霉（Monascuspurpureus） 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PRP蛋白的分離純化 將莜麥種子去殼粉碎，經(jīng)丙酮脫脂后用含50mmol/L NaCl，50mmol/L Tris－HCl，pH8.0的緩沖液溶解，14000r/min 4℃離心30min，收集上清液，加入固體硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀，收集30%～60%（NH4）2SO4沉淀。用50mmol/L Tris－HCl，pH8.0緩沖液懸浮，并用相同緩沖液在4℃進(jìn)行透析。將透析后的樣品離心后上樣到經(jīng)50mmol/L Tris－HCl，pH8.0緩沖液平衡的DEAE－Sepharose Fast Flow柱，進(jìn)行鹽離子濃度梯度洗脫。收集活性峰，濃縮后上樣于50mmol/L Tris－HCl，150mmol/L NaCl pH8.0平衡的Superdex－200層析柱，收集活性部分，濃縮后進(jìn)行SDS－PAGE電泳鑒定。

1.2.2 PRP分子量的測(cè)定 采用Superose12（10/30）預(yù)裝柱于AKTA purifier系統(tǒng)，用20mmol/L Tris－HCl，100mmol/L NaCl，pH8.0緩沖液預(yù)平衡凝膠柱，流速為0.5mL/min，室溫280nm紫外檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子為牛血清白蛋白（136ku）、卵清蛋白（45ku）、胰蛋白酶（24ku）、溶菌酶（14.4ku）。根據(jù)Kav－lgMr作圖，求得該樣品的天然分子量。Kav=（Ve－V0）/（Vi－V0），其中Ve、Vi、V0分別是洗脫體積、柱體積和外排體積。亞基數(shù)目和亞基分子量采用SDS－PAGE分析。

1.2.3 PRP抗真菌活性分析 抗真菌活性的鑒定采用牛津杯法[11]。配制PDA培養(yǎng)基（成分：200g土豆，20g葡萄糖，2g磷酸二氫鉀，1g結(jié)晶硫酸鎂，10mgVB1），將菌株（白腐菌、毛殼菌、紅曲霉）點(diǎn)種于培養(yǎng)基的中心，于30℃條件下培養(yǎng)，當(dāng)其菌落直徑長(zhǎng)至1～2cm時(shí)向菌落的外圍加入滅菌的牛津杯，將該樣品和不含該樣品的其他條件完全相同的含50mmol/L NaCl的20mmol/L Tris－HCl，pH8.0緩沖液通過(guò)濾膜除菌加入牛津杯內(nèi)，于4℃放置24h使其充分?jǐn)U散，然后將平板放入30℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行觀察。

1.2.4 PRP幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定 采用3，5－二硝基水楊酸（DNS）法[12－13]。將100μL含10mg/mL的膠體幾丁質(zhì)與相同體積的0.467mg/mL PRP蛋白在37℃下保溫30min后，加入1mL 3，5－二硝基水楊酸顯色劑，沸水浴10min終止反應(yīng)，最后用蒸餾水定容至5mL，于540nm處測(cè)定光吸收值。以不加PRP作為對(duì)照。

幾丁質(zhì)酶活力的定義為：在37℃條件下，每分鐘產(chǎn)生1μmol N－乙酰－D－氨基葡萄糖所需的酶量。

1.2.5 溫度對(duì)PRP幾丁質(zhì)酶活性的影響 將電泳純的莜麥PRP蛋白，分別置于25、35、45、55、65、75℃條件下，在pH8.0的0.1mol/L Tris－HCl緩沖液中保溫30min，進(jìn)行酶活性測(cè)定，確定最適反應(yīng)溫度。將莜麥PRP蛋白在上述溫度下，先保溫30min，然后冰浴10min，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行酶活測(cè)定。

1.2.6 pH對(duì)PRP幾丁質(zhì)酶的活性的影響 配制一系列100mmol/L的pH緩沖液：pH2～5為醋酸鹽緩沖液，pH6～8為磷酸鹽緩沖液，pH9～10為硼酸鹽緩沖液。將莜麥PRP蛋白在上述不同緩沖液于中37℃保溫30min，然后在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定PRP幾丁質(zhì)酶活性，確定PRP的幾丁質(zhì)酶活性pH穩(wěn)定性。最適pH的確定采用在上述不同pH條件下進(jìn)行活性測(cè)定。

1.2.7 金屬離子對(duì)PRP蛋白活性的影響 先將莜麥PRP蛋白與各金屬離子在37℃保溫10min后，再加入10mg/mL幾丁質(zhì)膠體底物，37℃反應(yīng)30min，DNS法測(cè)定其酶活，以不含金屬離子的緩沖液為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRP蛋白的純化

莜麥種子經(jīng)丙酮脫脂，獲得的粗蛋白溶液利用硫酸銨鹽析以及DEAE陰離子柱層析結(jié)合Superdex－200層析柱，我們首次從莜麥種子中分離到電泳純的PRP蛋白。采用SDS－PAGE分析蛋白的分子量大約在20ku左右，分子量接近病程相關(guān)蛋白的分子量范圍（圖1）。

圖1 12%SDS－PAGE檢測(cè)PRP蛋白的純化Fig.1 PurificationofPRPproteinsdeterminedby12%SDS－PAGE

2.2 蛋白分子分子量的測(cè)定

圖2 分子排阻層析對(duì)天然PRP蛋白分子量的測(cè)定Fig.2 Determination of nature PRP molecular weight by molecular exclusion chromatography

將獲得的電泳純PRP蛋白和標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)上樣于Superose12分子排阻層析，進(jìn)行分子量的測(cè)定。PRP的洗脫體積為15.21mL，相應(yīng)其Kav值為0.469，lgMr為4.37，根據(jù)Kav－lgMr作圖，可知其相對(duì)分子量為23.76ku（圖2），而SDS－PAGE結(jié)果顯示其分子量為22ku，進(jìn)一步說(shuō)明莜麥PRP蛋白是以單體形式存在的小分子量蛋白質(zhì)（圖3）。該分子量也接近于TLP一類(lèi)的PRP蛋白。

圖3 12%SDS－PAGE對(duì)PRP單體及亞基數(shù)的分析Fig.3 Analyze of PRP monomer and subunit by 12%SDS－PAGE

2.3 PRP抗真菌活性的鑒定

真菌主要是以菌絲方式進(jìn)行擴(kuò)散生長(zhǎng)，若遇抑菌物質(zhì)，菌落生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生類(lèi)似彎月的菌落邊緣形態(tài)。從圖4中也可以定性地觀察到，PRP對(duì)白腐菌的抑菌效果最明顯，毛殼菌次之，對(duì)紅曲霉的抑制最不明顯，并且抑制活性存在劑量依賴(lài)性，其最小抑制濃度為30μg/mL。

圖4 PRP對(duì)真菌的抑制活性分析Fig.4 Inhibition activity of PRP to fungus

2.4 PRP幾丁質(zhì)酶活性的最適溫度及pH

將PRP分別在25～75℃溫度范圍內(nèi)，測(cè)定其幾丁質(zhì)酶的活性，以及在上述溫度保溫30min后，置冰浴10min，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定不同保溫處理的PRP樣品，結(jié)果顯示PRP的幾丁質(zhì)酶活性在55℃以下，酶活可以保留80%活力，具有良好的熱穩(wěn)定性，當(dāng)高于65℃，其酶活急劇下降；PRP的幾丁質(zhì)酶活性的最適溫度為45℃（圖5）。比李奕雅[16]等報(bào)道的花生中的幾丁質(zhì)酶溫度40～50℃范圍更大。

圖5 溫度對(duì)PRP幾丁質(zhì)酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on PRP fungus activity

將相同量的PRP蛋白，溶解在0.1mol/L的不同pH緩沖液中（pH2～5為醋酸鹽緩沖液，pH6～8為磷酸鹽緩沖液，pH9～10為硼酸鹽緩沖液），保溫30min，按1.2.4標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行活性測(cè)定。結(jié)果表明，PRP在pH5.0時(shí)活力最高。而不同pH條件下保溫后，再在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行活性測(cè)定，PRP在pH5.0～8.0可以穩(wěn)定存在，并顯示幾丁質(zhì)酶的活性（圖6）。該性質(zhì)與李奕雅[14]等報(bào)道的花生中的幾丁質(zhì)酶pH范圍相似。

圖6 pH對(duì)PRP幾丁質(zhì)酶活的影響Fig.6 Effect of pH on PRP fungus activity

2.5 金屬離子對(duì)PRP幾丁質(zhì)酶活性的影響

在PRP測(cè)活體系中添加終濃度為1mmol/L的不同金屬離子，保溫30min后，利用1.2.4標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定?？梢钥闯?，Mn2+有明顯的促進(jìn)作用；Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Fe3+、Ca2+的促進(jìn)作用不明顯；Co2+、Ni2+、Cu2+具有明顯的抑制作用（圖7）。而綠僵菌中金屬離子Zn2+、Ca2+、Ba2+和Mn2+離子對(duì)幾丁質(zhì)酶活性有明顯的促進(jìn)作用，而Hg2+、Co2+和Fe2+離子具有顯著抑制幾丁質(zhì)酶活性的作用[15]。

圖7 金屬離子對(duì)PRP幾丁質(zhì)酶活性的影響Fig.7 Effect of metal ions on PRP fungus activity

3 結(jié)論與討論

植物中普遍存在的抗病機(jī)制有兩種：過(guò)敏反應(yīng)（hypersensitive response，HR）和系統(tǒng)獲得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）[16]。自從煙草中的一些病程相關(guān)蛋白如幾丁質(zhì)酶和β－1，3－葡聚糖酶被鑒定為具有潛在的抗真菌活性之后，病程相關(guān)蛋白參與植物系統(tǒng)獲得性抗性的結(jié)論被廣泛接受，但其作用機(jī)制尚不清楚。

莜麥的PRP至今未見(jiàn)任何國(guó)內(nèi)外報(bào)道。利用硫酸銨沉淀、陰離子交換層析，從莜麥種子中分離提取到的一種病程相關(guān)蛋白，純化步驟簡(jiǎn)單，樣品純度高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其不僅有胰蛋白酶抑制活力，還具有抗真菌活性，進(jìn)一步檢測(cè)到其具有一定的幾丁質(zhì)酶活性。其活力和莜麥種子的真正意義上的幾丁質(zhì)酶活力相比大約是其1/10的水平（結(jié)果未顯示），并且Mn2+能明顯地促進(jìn)其酶活。其抗真菌的活性可能的機(jī)制是通過(guò)其發(fā)揮幾丁質(zhì)酶的活性來(lái)顯示。但是病程相關(guān)蛋白的作用方式是否類(lèi)似于動(dòng)物體內(nèi)的免疫蛋白，還有哪些重要因子同時(shí)參與，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及基因表達(dá)的具體途徑怎樣，SAR和PRP的內(nèi)在關(guān)系如何，這些均有待更多PRP結(jié)構(gòu)的解析、基因表達(dá)調(diào)控的闡明及PRP作用模式的建立。

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Purification and characterization of pathogens-related proteins from Avena nuda

YAN Yong-fei，SHI Ya-wei*
（Institute of Biotechnology，Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

Pathogens-related proteins extensively existed in higher plants，which could be induced by various microorganism and belong to disease-resistant proteins that are attracted in the application fields.Through defatting with acetone，30%～60%（NH4）2SO4precipitation and DEAE ion exchange chromatography，Superdex-200 chromatography，pathogens-related proteins with the activity of chintinase was purified from the seeds of Avena nuda.The enzyme was stable from pH2.0～7.0 with optimum pH at 5.0.The optimum temperature of the enzyme was 45℃，and its activity was rapidly lost at temperatures above 65℃.The relative molecular weight was about 23.7ku.The growth of Trametes sp.SQ01 and Chaetomium sp.R01 were inhibited by the enzyme，with lowest dose of 30μg/mL.

pathogens-related proteins；Avena nuda；purification；characterization

TS210.1

A

1002－0306（2012）01－0094－04

2010－11－11 *通訊聯(lián)系人

閆永飛（1986－），女，碩士研究生，研究方向：蛋白質(zhì)工程。

太原市明星專(zhuān)項(xiàng)資助。