范智權，侯建軍，夏曉芬，梅芳芳，王元川，李杰東

（湖北師范學院 生命科學學院，湖北 黃石 435002）

五氯酚鈉為淡黃色或白色粉末，具有良好的水溶性，在自然界中降解緩慢，并可富集于底泥中，長期使用可造成環(huán)境污染和生物蓄積。其污染環(huán)境后，可通過食物鏈或其他途徑進入生物體內，從而對人、畜等生物體造成毒害：大劑量PCP-Na進入生物體內，可引起急性中毒甚至死亡；小劑量PCP-Na則具有潛在的遺傳毒性[1,2]。其作用機制主要是干擾生物代謝過程中的氧化磷酸化[3,4]。

環(huán)棱螺棲息于淤泥底質的水體中，活動能力較弱，對污染避讓能力較差，水體環(huán)境質量的好壞對其生長和繁殖有著重要影響。因此，環(huán)棱螺可作為水污染的指示生物[5]。環(huán)棱螺的上述生物標志物能夠解釋污染物五氯酚鈉在水環(huán)境中對其進行毒性脅迫作用的機理，從而可用于評估水環(huán)境中污染物的生態(tài)風險。本實驗以PCP-Na為目標毒性物質，用生物標志物法來研究PCP-Na對環(huán)棱螺的毒理效應。

1 材料與方法

1.1 材料

環(huán)棱螺采自于湖北省黃石市磁湖，質量2±0.2g，螺高16.77～21.70mm，螺寬11.75～13.03mm。實驗前選擇健康的環(huán)棱螺放在水箱中適應和馴養(yǎng)一個星期。馴養(yǎng)期間，實驗用水為曝氣3d 的自來水，每日換水一次，其它飼養(yǎng)環(huán)境條件是：pH 6.4，飼養(yǎng)溫度16～25 ℃；急性毒理實驗前1天停止喂食，實驗期間不喂食[5]。

1.2 急性毒理實驗[6]

首先進行預實驗，使用不同濃度的五氯酚鈉溶液（濃度為0.1～1.6mg·L-1）在30cm×20cm×8cm的水箱進行培養(yǎng)，培養(yǎng)體積為2L，每組放入環(huán)棱螺6只，遮光，觀察環(huán)棱螺的活動，記錄其死亡情況，以確定最大耐受濃度(LC0)和絕對致死濃度(LC100)。

根據預實驗結果，在急性毒理實驗時，設定濃度為0.1～0.8mg·L-1的7個梯度實驗組和一個空白對照。在水箱中加入實驗飼養(yǎng)水體積2L，每天更換全部實驗飼養(yǎng)水，每隔12h觀察記錄環(huán)棱螺的活動和存活情況，連續(xù)觀察96h，及時取出死亡個體，記錄環(huán)棱螺的藥物中毒情況及其死亡數量。采用寇氏(Korbor)法計算96h急性毒性實驗的半致死濃度LC50和其95%的置信區(qū)間以及安全濃度[7-9]。

1.3 毒性暴露實驗[10-12]

根據急性毒理實驗結果，得到五氯酚鈉的半致死質量濃度為：0.411mg·L-1。參考國家漁業(yè)水質標準中所規(guī)定的五氯酚鈉的濃度為0.01mg·L-1，設置五氯酚鈉的質量濃度梯度為：0.00 mg·L-1，0.02 mg·L-1，0.04 mg·L-1，0.10 mg·L-1進行實驗。實驗生物的染毒方式采用靜態(tài)水質法，水溫為16～25℃，pH6.4。在水箱中裝入2L的實驗用水，每一質量濃度組放入環(huán)棱螺 120只。將環(huán)棱螺進行不同五氯酚鈉濃度梯度、不同時間的毒性暴露實驗。實驗期間，每天更換相同濃度的實驗用水一次，每隔 24h 隨機抽取12只環(huán)棱螺，置于冰盤中進行解剖，取其肝臟。用預冷的 PBS 緩沖液清洗，用濾紙吸干。

稱取環(huán)棱螺肝臟放入玻璃勻漿器中，加入20倍體積的預冷PBS緩沖液（pH7.2）研磨成勻漿（所有操作均在冰上進行）。4℃ 10 000g離心10min，取上清測定蛋白質含量，并進行相關生物標志物的測定[13]。GSH活性的測定采用DTNB法[14]。SOD活性的測定采用NBT法[15]。 酶活力單位定義為：每mg 組織蛋白在1 mL 反應液中SOD 抑制率達50 %時所對應的SOD 量為1個活性單位(U) 。CAT活性的測定采用紫外吸收法[16]。酶活力單位定義為：以1min內SOD240減少0.1的酶量為1個酶活單位（U）。丙二醛（MDA）的測定采用TBA法[17]。

1.4 數據處理

采用Origin8.0軟件繪圖。SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD法進行多重比較（P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著）。

2 結果分析

2.1 環(huán)棱螺的中毒癥狀與死亡鑒定

環(huán)棱螺在接觸實驗用水后，高濃度組首先出現中毒癥狀。其中毒癥狀表現為：腹足回縮力量隨暴露時間的增加逐漸減弱，并伸出部分于殼外，伴有白色絮狀物質溢到殼外；隨著暴露時間進一步延長，環(huán)棱螺對外界刺激反應愈加遲緩直至死亡，腹足全部伸出殼外，腫脹泛白，對外界刺激再無反應，最終內臟與外殼脫離。

2.2 五氯酚鈉對環(huán)棱螺半致死濃度和安全濃度的計算

用 SPSS 軟件計算出 Na-PCP對環(huán)棱螺 96h的 LC50及其 95%置信區(qū)間分別是 0.411mg·L-1，(0.331～0.536mg·L-1)，用常規(guī)計算方法計算Na-PCP對環(huán)棱螺的安全濃度為0.0411mg·L-1。

圖1 PCP-Na對環(huán)棱螺肝臟中GSH含量的影響

2.3 環(huán)棱螺各生物標志物的變化規(guī)律分析

2.3.1 不同濃度五氯酚鈉對環(huán)棱螺肝臟中GSH含量的影響

如圖1所示，暴露24h時，0.04 mg·L-1和0.10 mg·L-1劑量組肝臟中GSH含量顯著增加（P＜0.01）。48h時，0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1劑量組肝臟中GSH的含量有所上升，但 0.10 mg·L-1劑量組肝臟中GSH較24h時含量下降。72h時，0.02 mg·L-1劑量組肝臟中 GSH 含量顯著升高（P＜0.01），0.04 mg·L-1和0.10 mg·L-1劑量組肝臟中GSH含量降低。到96h時，0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1劑量組含量依舊高于對照組（P＜0.01），但0.10 mg·L-1劑量組肝臟組GSH含量恢復到對照組水平。

2.3.2 不同濃度五氯酚鈉對環(huán)棱螺肝臟中SOD活性的影響

圖2顯示，在24h時，低劑量組（0.02mg·L-1）肝臟中的SOD活性顯著高于對照組（P＜0.05），而 0.04 mg·L-1和 0.10mg·L-1劑量組肝臟中的SOD活性均受到抑制。48h時，各劑量組肝臟中的SOD均受到顯著抑制（P＜0.01）。48h后，0.10 mg·L-1劑量組SOD活性持續(xù)增高，到96h時其活性顯著高于對照組；0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1劑量組肝臟中SOD活性先下降，到72h時，兩劑量組的酶活開始回升，到96h時活性達到對照組水平。

2.3.3 不同濃度五氯酚鈉對環(huán)棱螺肝臟中CAT活性的影響

圖2 PCP-Na對環(huán)棱螺肝臟中SOD活性的影響

圖3 PCP-Na對環(huán)棱螺肝臟中CAT活性的影響

根據圖3的結果，環(huán)棱螺肝臟在五氯酚鈉暴露的0～24h內，CAT的活性均被誘導；但在24h后，各劑量組CAT活性均開始下降，48h時達到最低；從48h之后，各劑量組CAT活性開始升高，96h時明顯高于對照組（P＜0.01）。

圖4 PCP-Na對環(huán)棱螺肝臟中MDA含量的影響

2.3.4 不同濃度的五氯酚鈉對環(huán)棱螺肝臟中MDA含量的影響

圖4表明，PCP-Na脅迫初期（0～24h）各劑量組肝臟中的MDA含量均顯著升高 (P＜0.05)。在24h 時，0.02mg·L-1和0.04mg·L-1劑量組肝臟中MDA含量達到最大值。24h之后MDA含量開始回落，0.10mg·L-1劑量組在24-48h內，其MDA的含量仍繼續(xù)升高，在48h時達到最大值，此時含量明顯高于對照組（P＜0.01），隨后其含量逐漸下降，到 96h時，各劑量組肝臟中MDA的含量接近照組水平。

3 討論

3.1 五氯酚鈉暴露與環(huán)棱螺肝臟中GSH含量變化的關系

外源性化學物質進入生物細胞后，會導致大量活性氧的產生，活性氧是高活性的分子，與生物大分子如DNA、蛋白質和脂質相互作用而對生理過程產生影響。GSH作為非酶類抗氧化物質首先與外來化合物或自由基結合，保護細胞不受氧化損傷。當細胞中GSH不足以清除外來物質與自由基時，此時就會發(fā)生其他次級反應，如脂質過氧化或與細胞內其他大分子發(fā)生共價結合[18]。本次實驗中，0.02 mg·L-1和0.04 mg·L-1劑量組環(huán)棱螺肝臟中GSH含量隨著暴露時間的延長呈遞增的趨勢，原因可能是經五氯酚鈉實驗水處理使得肝臟中自由基含量增加，在沒有超過GSH對毒性物質的飽和誘導量時，GSH含量增加。而對于0.10 mg·L-1劑量組，環(huán)棱螺肝臟中GSH含量先上升后降低，GSH含量的降低可能與細胞對污染物及其代謝物解毒能力的飽和效應有關，也可能是污染物長期毒性暴露效應反應的結果[11]。

3.2 五氯酚鈉啟動環(huán)棱螺肝臟中抗氧化酶系統的機制

目前，很多研究把超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等作為評價污染物對水生生物產生氧化脅迫的重要生物標志物。它們的活性可由于污染物的脅迫而發(fā)生改變，從而可以間接地反映環(huán)境中污染物的存在，因而可作為污染物脅迫的有效指標。用特定反應中關鍵酶的變化來證實污染物的影響，可以指示污染物對生態(tài)系統所產生的生物學效應，并能科學地評價污染物的環(huán)境風險，從而具有重要的理論和實踐意義。SOD是使細胞免受氧化損傷的關健酶之一，能清除超氧自由基，催化使之轉化為H2O2和O2，也與生物的抗污染脅迫密切相關。在暴露實驗過程中的初期，暴露時間短，且環(huán)棱螺體內有非酶類抗氧化物質如GSH的作用，此時SOD和CAT活性沒有顯著升高。然而隨著暴露時間的延長，SOD活性能夠被顯著誘導。本實驗中，48h之后，暴露在不同濃度的五氯酚鈉溶液中的環(huán)棱螺抗氧化系統啟動，隨著活性氧自由基的大量產生，SOD被誘導，活性不斷上升，從而導致 H2O2在細胞中含量升高。CAT作為H2O2濃度的調節(jié)器，活性升高，加速分解H2O2。在本實驗中，SOD和CAT的相關關系為：r=0.810，P＜0.01，這表明這兩種酶密切相關，并具有一定的協同性。這與張清順等研究銅對梨形環(huán)棱螺抗氧化酶活性影響中SOD和CAT的相關性的結果一致[11]。

SOD和CAT共同組成了生物體內活性氧的防御系統，在清除超氧自由基、H2O2以及阻止或減少羥自由基形成等方面發(fā)揮了重要的作用。通常生物體內抗氧化系統處于一種平衡狀態(tài)，使自由基維持在一個較低的水平，從而能有效地防止氧自由基的毒害，一旦這種動態(tài)平衡受到破壞，就可能產生傷害作用[7]。因此很多研究把CAT和SOD作為評價外源化合物產生氧化脅迫的重要生物標志物。

3.3 五氯酚鈉對環(huán)棱螺肝臟的脂質過氧化作用

生物在逆境脅迫條件下，體內自由基積累會導致生物膜脂質過氧化(lipid perxidation)的發(fā)生，從而降低了膜的流動性和選擇通過性，破壞了生物膜的功能。MDA作為生物脂質過氧化的最終產物之一，其含量常被用來評價生物的脂質過氧化水平。在本次實驗中，在PCP-Na脅迫的前中期肝臟產生了大量的活性氧自由基，引發(fā)了脂質過氧化，使得各劑量組肝臟中 MDA含量均明顯升高，脂質過氧化損傷明顯。而在毒物的持續(xù)脅迫下，由于抗氧化酶系統的全面激活和GSH含量上升后產生的保護作用，使脂質過氧化水平降低，MDA含量逐漸恢復到正常水平。

3.4 GSH、抗氧化酶及MDA的互動關系探討

外源有機化合物及其代謝產物可引起生物體內活性氧自由基增加。為避免活性氧自由基引起蛋白氧化和脂質過氧化，使細胞受損，最終造成生物體正常生理機能的破壞，生物激活其體內的抗氧化防御系統，誘發(fā)非酶類抗氧化物質（如GSH）及抗氧化酶(如 SOD和CAT ) 的產生以清除機體內過多的活性氧自由基[19]。在五氯酚鈉脅迫初期，GSH含量升高，清除外來化合物及活性中間體。當GSH不足以清除外來物質及自由基時，就可能啟動抗氧化酶系統。在本次實驗中，表現為脅迫初期GSH含量增加，較長時間（如48h）暴露后，SOD及CAT活性均被誘導增加。

機體抗氧化系統是一個復雜的系統，由非酶和抗氧化酶組成的抗氧化系統在機體抵抗氧化脅迫和消除自由基損傷時起著重要作用，并且某些抗氧化成分之間還能相互影響。本實驗中，GSH、SOD、CAT及MDA圍繞自由基清除和對機體損傷這個功能核心，各自起著作用，彼此間又密切相關[20]。

環(huán)棱螺耐旱能力極強，移位距離很小，以其為實驗對象，采用生物標志法研究五氯酚鈉的毒理效應，能夠很好的反映五氯酚鈉對環(huán)棱螺的氧化損傷作用和環(huán)棱螺的防御作用機制，進而為探討持久性有機污染物對腹足動物的氧化損傷和防御作用機制提供基礎資料，同時也為污染物的生物監(jiān)測法提供更完善的資料。

[1]尹曉晨, 曾明, 王春香, 等. 五氯酚鈉對雄性小鼠的生殖毒性作用[J]. 生態(tài)毒理學報, 2008, 3(5): 473～478.

[2]李夢耀, 黎衛(wèi)亮, 錢會. 五氯苯酚的降解研究進展[J]. 安全與環(huán)境學報, 2007, 7(2): 32～35.

[3]劉和, 沈超峰, 王侃, 等. 多食鞘氨醇桿菌共代謝降解五氯酚[J]. 中國環(huán)境科學, 2004, 24(3): 294～298.

[4]宋瑞霞, 阮鴻潔, 景欣月, 等. 五氯酚鈉的細胞遺傳毒性研究[J]. 癌變畸變突變論著, 2007, 19(5): 355～357.

[5]曹正光, 蔣忻坡. 幾種環(huán)境因子對梨形環(huán)棱螺的影響[J]. 上海水產大學學報, 1998, 7(3): 200～205.

[6]胡秀彩, 邊延峰, 周捷, 等. 四種藥物對斑馬魚急性毒理實驗[J]. 水產養(yǎng)殖, 2012, 33(1): 43～47.

[7]鄭微云, 翁恩琪. 環(huán)境毒理學概論[M]. 廈門：廈門大學出版社, 1993. 57～58.

[8]周輝明, 吳志強, 袁樂洋, 等. 三種重金屬對鯉魚幼魚的毒性和積累[J]. 南昌大學學報, 2005, 29(3): 292～295.

[9]莊平, 王端芳, 石小濤, 等. 氟對西伯利亞鱘仔魚的急性毒性及安全濃度評價[J]. 生態(tài)毒理學報, 2009, 4(3): 440～445.

[10]張清順, 熊邦喜, 侯建軍. 低濃度銅暴露導致梨形環(huán)棱螺氧化脅迫及 DNA 損傷的研究[J]. 水生態(tài)學雜志, 2010, 3(5):49～55.

[11]張清順, 侯建軍, 劉香江, 等. 銅對梨形環(huán)棱螺抗氧化酶活性和金屬硫蛋白含量的影響[J]. 水生生物學報, 2009, 33(4):717～725.

[12]陳建華, 閻斌倫, 高煥, 等. Cd2+、Cu2+及石油烴對毛蚶谷胱甘肽S-轉移酶活性的影響[J]. 水產科學, 2012, 31(3): 137～142.

[13]侯建軍, 張清順, 熊邦喜, 等. 二價鎘對梨形環(huán)棱螺毒理效應的研究[J]. 中國農業(yè)大學學報, 2009, 14(3):54～62.

[14]劉娟, 王雅琴, 劉剛, 等. 發(fā)酵液中還原型谷胱甘肽三種測定方法的改進及其比較[J]. 北京化工大學學報, 2004, 31(3):35～38.

[15]張志良, 瞿偉. 植物生理學實驗指導[M]. 北京：高等教育出版社, 2009. 218～219.

[16]徐鏡波, 袁曉凡, 郎佩珍. 過氧化氫酶活性抑制的紫外分光光度的測定[J].環(huán)境化學, 1997, 16(1): 73～76.

[17]張志良, 瞿偉. 植物生理學實驗指導[M]. 北京：高等教育出版社, 2009. 227～228.

[18]劉慧君, 趙媛, 胡玲玲, 等. 農藥生態(tài)毒理學的研究和應用[J]. 植物保護, 2009, 35(1): 22～26.

[19]Livingstone DR. Contaminant-stimulated reactive oxygen species production and oxidative damage in aquatic organisms[J]. Marine Pollution Bulletin, 2001, 42(8): 656～666.

[20]李周直, 沈慧娟, 蔣巧根, 等. 幾種昆蟲體內保護酶系統活力的研究[J]. 昆蟲學報, 1994, 37(4): 399～403.