曾 毅，李 利，郭鑫武，鄧國宏，李俊男，王 琳△

（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院：1.婦產(chǎn)科；2.傳染病研究所，重慶400038）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一個全球性的健康 問 題[1]。HBV表面抗原（HBV surface antigen，HBs Ag）陽性母親的新生兒出生后立即接種乙型肝炎疫苗（Hepatitis B vaccine，HBVac）或聯(lián)合應(yīng)用乙型肝炎免疫球蛋白（hepatitis B immunoglobulin，HBIG）可有效阻斷分娩過程感染和產(chǎn)后感染，但對已發(fā)生的宮內(nèi)感染無阻斷作用[2]，通過這種途徑感染的新生兒幾乎終身攜帶病毒，是造成免疫失敗的主要原因[3－5]，20%～25%發(fā)展為肝硬化及肝癌，宮內(nèi)感染的女性新生兒很有可能將來通過妊娠將病毒再傳遞給她們的下一代。HBV宮內(nèi)傳播的途徑主要有胎盤途徑、外周血單核細胞（peripheral blood monocytes，PBMCs）途徑及經(jīng)生殖細胞的傳播。其中胎盤的滲漏和胎盤細胞的感染是主要的途徑[6]。HBe Ag可以經(jīng)過局部的胎盤滲漏通過胎盤[7]，隨著胎盤屏障的破壞，造成母親血液進入胎兒的血液循環(huán)中，或者通過“細胞途徑”促進感染經(jīng)胎盤的傳播[8]。母親HBe Ag血清型陽性及高病毒載量為胎盤HBV感染明確的正相關(guān)因素[8]。本研究對HBV宮內(nèi)傳播的兩對母子血清樣本中的HBV病毒株序列建立進化關(guān)系類型，進行遺傳進化分析，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2008年1月至2011年1月第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院產(chǎn)科就診的兩對乙型肝炎母子無癥狀攜帶者。母親均為重慶地區(qū)漢族人，年齡分別為24（M1，新生兒為N1）和25（M2，新生兒為N2）歲，孕前及孕期確診為HBV感染（HBs Ag、HBe Ag、抗－HBc陽性），伴HBV病毒高載量（滴度均大于1×106log10 copies／mL），肝炎病毒A、C、D、E抗體陰性，生命體征及肝功能指標(biāo)基本正常，均臨床診斷為無癥狀的HBs Ag攜帶者，實驗前均未接受乙型肝炎疫苗接種及抗病毒治療。產(chǎn)后立即收集母親的靜脈血樣及新生兒的股靜脈血樣，父母及其子女的血清樣本－70℃超低溫冰箱保存。兩對乙型肝炎母子無癥狀攜帶者的臨床資料見表1。入選標(biāo)準(zhǔn)：新生兒在出生24 h內(nèi)、免疫接種前檢測示HBs Ag及HBV－DNA雙陽性，母親是HBs Ag攜帶者，父親非HBs Ag攜帶者，新生兒常規(guī)乙型肝炎疫苗預(yù)防接種及注射乙型肝炎免疫球蛋白后，產(chǎn)后1個月新生兒的血液樣本中，HBs Ag及HBV－DNA雙陽性[8]。

1.2 試劑 引物參照文獻設(shè)計（上海生工生物工程公司合成），柱式液體樣品總核酸抽提試劑盒（W7291）（上海華舜生物技術(shù)有限公司，中國），LATaqDNA聚合酶（Takara公司，日本），長片段TA克隆試劑盒（TOPO－XL－PCR Cloning kit）（Invitrogen公司，美國），E.Z.N.ATM質(zhì)粒DNA小抽試劑盒（美國Omega公司），EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶（美國Promega公司）。

表1 兩對乙型肝炎母子無癥狀攜帶者的臨床資料

1.3 方法

1.3.1 血清DNA提取 采用上海華舜生物技術(shù)有限公司的柱式液體樣品總核酸抽提試劑盒（W7291）提取。

1.3.2 母子HBV基因組全長序列的擴增、克隆、酶切鑒定和測序 對高病毒載量血清（＞107log10 copies／mL）參考文獻[9]HBV全序列基因組擴增所采用的引物及擴增方法。HBV基因組全長PCR引物為P1：5′－CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA－3′；P2：5′－CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G－3′。PCR參數(shù)為預(yù)變性94℃5 min，94℃25 s、55℃30 s、72℃3 min 30 s（共35個循環(huán)），延伸72℃10 min。膠回收純化目的基因，采用Invitrogen公司提供的TA Cloning?Kit－One－Step PCR Cloning試劑盒中的pCR?－2.1T載體快速連接5 min，重組載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)TOP10，致死基因ccdB及卡那霉素篩選陽性菌落。提取重組質(zhì)粒，EcoRⅠ酶切鑒定，每個患者選33個酶切鑒定正確重組質(zhì)粒的菌液，送華大生物工程公司測序，測序引物M13。

1.3 基因序列比對方法 各樣本的HBV基因組全長序列為3.2 kb，采用CLUSTAL X1.83進行序列比對[10]，用MEGA 5.05軟件計算遺傳距離[11]，選擇最佳替代模型，PAUP4.0 b 10和Treeview進行系統(tǒng)進化分析。用MEGA5.05軟件建立3種數(shù)據(jù)庫，第1種包括一個數(shù)據(jù)包，內(nèi)有兩對母子所有的45個序列，命名為MN；第2種包含2個數(shù)據(jù)包，每個數(shù)據(jù)包內(nèi)為一對母子的序列，命名為M1N1、M2N2；第3種包含4個數(shù)據(jù)包，每個數(shù)據(jù)包內(nèi)為單一的某一母親或孩子的序列，命名為M1、N1、M2和N2。M1和M2的序列為C1型基因型，M2和N2的序列為B2基因型，選擇標(biāo)準(zhǔn)序列B2型（AF100309）和C1型（X04615）分別作為外圍序列進行比對。

采用MEGA5.05軟件計算母子之間的遺傳距離，根據(jù)貝葉斯標(biāo)準(zhǔn)計算的結(jié)果選擇Kimura 2－parameter替代模型分析轉(zhuǎn)換和易位。MN數(shù)據(jù)包的系統(tǒng)進化樹用鄰接法通過1 000次自展法重復(fù)計算建立。對第2種和第3種數(shù)據(jù)包運用最大似然法（maximumLikelihood method，ML）和最大簡約法（maximum parsimony method，MP）進行系統(tǒng)進化分析。PAUP4.0 b 10建構(gòu)ML和MP系統(tǒng)進化樹。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)做進化樹構(gòu)建和分析的參數(shù)設(shè)置，構(gòu)建進化樹并進一步分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5軟件進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 母子HBV L－PCR擴增及重組質(zhì)粒酶切鑒定 血清DNA模板擴增出約3 200 bp的DNA片段，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切，可產(chǎn)生3 200 bp及3 500 bp兩個片段，均與預(yù)期目的基因大小相符合。見圖1、2。

2.2 HBV病毒株的遺傳進化 兩對母子的遺傳距離及遺傳多態(tài)性見表3～4。

2.3 系統(tǒng)進化結(jié)果

2.3.1 對于所有45個病毒株 基于從2對母子中選擇的3.2 kb的HBV病毒株基因組，MEGA5.05軟件鄰接法構(gòu)建的進化樹（圖3）。在這個拓撲結(jié)構(gòu)中，M1N1和M2N2之間沒有重疊，分別聚集在一側(cè)。M1和N1聚集后混雜分布，未形成單源群，也沒形成各自的單源群；M2和N2非單一起源，雖然M2的大部分優(yōu)勢株聚為一枝，但少部分M2與N2聚集形成另1枝。

圖1 HBV基因組全長序列PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

圖2 HBV L－PCR擴增及重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖

圖2 HBV 3.2 kb全長序列鄰接法進化樹

2.3.2 每對母子的HBV病毒株 圖3A、3B為M1N1的ML、MP的進化樹。M1和N1聚集后混雜分布，未形成總的單源群，也沒形成各自的單源群，均沒有明顯的優(yōu)勢株，有一株新生兒的病毒株N1－01為除3條新生兒株（N1－02，N1－03，N1－04）外其余母子序列的起源。

圖3C、3D為M2N2的ML、MP的進化樹。大量M2的優(yōu)勢株聚集在一枝上，但N2卻與小部分M2（M2－01，M2－02，M2－03）聚集在另一枝，兩枝為姐妹群，N2可形成單源群，并有一個共同的起源M2－01和M2－03（2株的序列相同，視為同一病毒株）。

圖3 M1N1、M2N2的進化樹圖

表3 M和N的遺傳距離和遺傳多態(tài)性

表4 每對母子的遺傳距離和多樣性

3 討 論

HBV宮內(nèi)傳播的途徑主要有胎盤途徑、PBMCs途徑及經(jīng)生殖細胞的傳播。其中胎盤的滲漏或胎盤細胞的感染是主要的途徑[6]。通常認(rèn)為胎盤滲漏是含有高濃度HBV的母血直接進入胎兒血循環(huán)中。這個過程中，母親的病毒株不經(jīng)受選擇壓力，新生兒的病毒與母親的一致。通過宮內(nèi)傳播的細胞途徑的新生兒感染是絨毛毛細血管內(nèi)皮細胞感染的結(jié)果。在通過胎盤屏障的過程中，母親的優(yōu)勢病毒株被過濾，只有那些更適應(yīng)新環(huán)境的病毒株得以繼續(xù)繁殖。在通過每層絨毛毛細血管巨大選擇壓力的作用下，許多母親的病毒株為了適應(yīng)新環(huán)境而發(fā)生突變，特別是感染發(fā)生在孕早期的病例，母子病毒株之間的遺傳距離相應(yīng)增大，N由M進化而來。若感染發(fā)生在妊娠晚期，M和N病毒之間的進化距離則相對縮短。

有研究根據(jù)8對發(fā)生HBV宮內(nèi)感染的母子的HBV病毒株序列進行進化樹分析，推測出4種可能的情況：第1種，母子的序列聚集為一枝，歸因為局部胎盤滲漏；第2種，母親和胎兒的病毒株分別聚集為2個獨立的姐妹進化枝，母子病毒株之間的遺傳距離相對較大，可用細胞途徑加以解釋；第3種，從拓撲結(jié)構(gòu)看，母親的病毒株是新生兒病毒株的起源，這種情況與傳播的細胞途徑相一致；第4種，母親病毒株與一些新生兒的病毒株聚集為一枝，其余的新生兒病毒株聚集為另一單源群，可用聯(lián)合傳播途徑加以解釋[12]。

在本研究中，M2N2的進化模式符合第3種細胞途徑進化模式，大量M2的優(yōu)勢株聚集在一枝上，但N2卻與小部分M2（M2－01，M2－02，M2－03）聚集在另一枝，2枝為姐妹群，N2可形成單源群，并有一個共同的起源母親病毒株M2－01和M2－03（2株的序列相同，視為同一病毒株）。在細胞途徑中，胎盤屏障阻礙了大部分病毒株的通過，只有那些在層層選擇壓力下發(fā)生突變的病毒株適應(yīng)了新環(huán)境后得以突破，從而感染胎兒，因此，大部分M2優(yōu)勢株聚集在一條進化枝上，為沒能突破的株系，而少部分發(fā)生變異的病毒株通過細胞途徑感染胎兒，并成為新生兒病毒株的起源，故N2為一單源群，N2的上游為少量的M2病毒株。

但在M1N1的序列進化樹中，卻發(fā)現(xiàn)了與上述4種模式不同的情況，M1和N1聚集后混雜分布，未形成總的單源群，也沒形成各自的單源群，均沒有明顯的優(yōu)勢株，有一株新生兒的病毒株N1－01為除3條新生兒株（N1－02，N1－03，N1－04）外其余母子序列的起源。M1N1各序列間的遺傳距離明顯大于M2N2。可能原因是：在孕早期發(fā)生胎盤滲漏導(dǎo)致胎兒感染，但胎盤滲漏并不是一個持續(xù)的過程，可能通過修復(fù)得以終止，HBV病毒分別在胎兒和母親兩個相對獨立的環(huán)境中演進。感染初期胎兒和母親的HBV病毒株之間來源相同，序列無明顯差異，為同一個基礎(chǔ)。隨著時間的推移，由于胎盤屏障的過濾和阻斷功能，胎兒環(huán)境相對穩(wěn)定，病毒株所經(jīng)受的選擇壓力較小。而母親在孕期可能面臨來自內(nèi)外環(huán)境的各種壓力，病毒株變異速率加快，遺傳距離的計算中，M1也明顯比M2及N1要大，形成更多、遺傳距離更遠的變異株。

有研究報道，發(fā)生先兆流產(chǎn)和（或）早產(chǎn)，大部分宮內(nèi)傳播是因為母血中HBe Ag的胎盤滲漏[7，13]。有研究顯示，HBV感染胎盤毛細管內(nèi)皮細胞是宮內(nèi)傳播的一個主要危險因素。HBV經(jīng)胎盤傳播途徑可能是胎盤的細胞與細胞之間的傳遞[14－15]。本研究結(jié)果顯示，2組中M1N1通過胎盤滲漏傳播的可能性大，M2N2則更有可能通過細胞途徑傳播。因為納入研究的病例數(shù)目及每對母子準(zhǔn)種數(shù)目的局限，系統(tǒng)進化樹不能完全說明病毒株的進化過程，但從這些樹中可以看出部分組間差異，并推測出可能的傳播模式，并據(jù)此采取相應(yīng)的預(yù)防措施及干預(yù)手段減少宮內(nèi)傳播的風(fēng)險。

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