王 煥，吳修文，吳 煒，張 勇，萬(wàn)千雪，金 星，徐淑秀△，彭 曦▲

（1.蚌埠醫(yī)學(xué)院護(hù)理系，安徽蚌埠233030；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍燒傷研究所／創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400038）

燒傷應(yīng)激、缺血、缺氧和過(guò)度炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致腸道組織結(jié)構(gòu)受損，腸黏膜屏障破壞，腸腔中的細(xì)菌、毒素可穿越腸黏膜，是形成燒傷后“腸源性感染”和“腸源性高代謝”的病理生理基礎(chǔ)[1]。因此，如何減輕嚴(yán)重創(chuàng)傷后腸黏膜損傷，加速腸黏膜修復(fù)是目前燒傷救治中的重要環(huán)節(jié)。盡管已有采用生長(zhǎng)激素、胃腸肽及生長(zhǎng)因子治療燒傷后胃腸損害的報(bào)道，但這些藥物特異性不強(qiáng)，穩(wěn)定性不高，胃腸道給藥療效不佳[2]，臨床使用受限。腸三葉因子（intestinal trefoil factor，ITF）是由腸道杯狀細(xì)胞特異分泌的小分子多肽，因其具有特殊的“三葉草”型空間結(jié)構(gòu)，非常穩(wěn)定，具有耐酸堿和蛋白酶消化的特性[3]。在腸易激綜合征、潰瘍性結(jié)腸炎、短腸綜合征等消化系統(tǒng)疾病的治療中ITF的療效已得到肯定[4]。但I(xiàn)TF是否能減輕燒傷后腸道損傷還鮮見(jiàn)報(bào)道，對(duì)ITF最佳給藥途徑也還不甚清楚。本研究擬采用燒傷小鼠模型，觀察給予重組人ITF（rhITF）對(duì)燒傷后腸道損傷的保護(hù)作用，并比較口服灌胃和皮下注射兩種給藥途徑在療效上的差異，為今后rhITF用于燒傷后腸黏膜的修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

1.1.1 燒傷模型的制作及分組 健康成年BALB／c小鼠104只，體質(zhì)量（23±3.1）g，雌雄不限（第三軍醫(yī)大學(xué)附屬大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。隨機(jī)分成4組，正常對(duì)照（control，C）組（n＝8）、燒傷對(duì)照（burned，B）組（n＝32）、口服灌胃rhITF（intragastric administration，IG）組（n＝32）和皮下注射rhITF（subcutaneous injection，SC）組（n＝32）。實(shí)驗(yàn)分燒傷前及燒傷后1、3、5、7 d 4個(gè)時(shí)相點(diǎn)。C組8只小鼠，其他各組每個(gè)時(shí)相點(diǎn)各8只小鼠。C組小鼠不予燒傷，其他3組小鼠燒傷前禁食12 h，1%戊巴比妥鈉（40 mg／kg）腹腔麻醉，背部電推剃毛，稱質(zhì)量后置剃毛區(qū)于80℃，水浴20 s，造成30%體表面Ⅲ度燒傷。傷后按40 mL／kg腹腔注入復(fù)方乳酸鈉抗休克。創(chuàng)面涂2%碘酊抗感染，每天2次，傷后給予標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.1.2 藥物來(lái)源及給藥方式 rhITF來(lái)源于本課題組的前期制備，采用畢赤酵母重組表達(dá)發(fā)酵，獲得的rhITF經(jīng)驗(yàn)證與理論值完全相符，毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)該重組蛋白毒副作用非常輕微。IG組小鼠在傷后2 h開(kāi)始rhITF灌胃，劑量為1.0 mg／kg，每次灌胃容量為0.5 mL，每天分2次給藥；在SC組小鼠頸部皮下注射等劑量的rhITF，每次注射容量為0.1 mL，每天2次。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

1.2.1 腸黏膜通透性測(cè)定 采用核素標(biāo)記蛋白法，經(jīng)尾靜脈注入锝99標(biāo)記的二乙三胺五乙酸螯合的人血清蛋白（99Tcm－diethylene triamine pentaacetic acid－h(huán)uman serum albumin，DTPA－HAS），劑量為1 480 kBq／kg，30 min后斷頭處死小鼠，測(cè)定腸腔灌洗液的放射性每分鐘計(jì)數(shù)值，以正常小鼠腸黏膜通量為1，用燒傷后各時(shí)相的放射性每分鐘計(jì)數(shù)值與之的比值來(lái)反映腸黏膜通透性的改變。由于99Tcm半衰期僅6 h，實(shí)驗(yàn)中要設(shè)衰變對(duì)照，校正所測(cè)放射性每分鐘計(jì)數(shù)值。

1.2.2 腸上皮細(xì)胞增殖指數(shù)測(cè)定 采用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，分離腸上皮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，75%乙醇固定，棄固定劑，PBS洗2次，加5 mg／mL的RNA酶0.5 mL，混勻，37℃水浴30 min，加50μg／mL的碘化丙啶染色液0.5 mL，搖勻，避光冷藏30 min，上機(jī)檢測(cè)，每份標(biāo)本分析1萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。據(jù)G1、S、G2及M各期細(xì)胞所占百分比，計(jì)算增殖指數(shù)（S＋G2＋M）。

1.2.3 血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活性測(cè)定 采用分光光度法，具體操作如下：每管中加入0.1 mol／L PBS 1.5 mL（p H 7.2），50μL辣根過(guò)氧化物酶（2μg），50μL鄰聯(lián)茴香胺（250μg），250μL血漿，最后加50μL尸胺（87.5μg），充分混勻后置37℃水浴30 min。測(cè)定波長(zhǎng)為436 nm。以上試劑除辣根過(guò)氧化物酶由深圳晶美公司提供外，其余均購(gòu)自Sigma公司。

1.2.4 病理形態(tài)學(xué)檢查 取所需時(shí)相點(diǎn)動(dòng)物部分回腸（距回盲部10 cm），置10%甲醛液中固定。常規(guī)石蠟包埋切片HE染色。用Olympus顯微鏡觀察病理切片。

1.2.4.1 黏膜損害指數(shù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 采用Ogura記分法，0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，并伴有毛細(xì)血管充血；2分：上皮下間隙擴(kuò)大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴(kuò)張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細(xì)胞變性、壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落；4分：上皮細(xì)胞層變性、壞死、脫落，部分絨毛脫落，固有層裸露，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血；5分：絨毛脫落，固有層崩解，出血或潰瘍形成。光鏡下每只小鼠腸道標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)視野，取平均值。

1.2.4.2 腸黏膜厚度測(cè)定 采用目鏡測(cè)微器測(cè)定法，在40倍光鏡下每張切片隨機(jī)測(cè)定6個(gè)視野黏膜厚度，取平均值作為小鼠腸黏膜厚度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用多因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

4組小鼠腸黏膜損傷指數(shù)、腸黏膜通透性、血漿DAO活性、腸黏膜細(xì)胞增殖指數(shù)和黏膜厚度見(jiàn)表1～5。

表1 C組及燒傷后小鼠不同時(shí)相點(diǎn)腸黏膜損傷指數(shù)比較（±s）

表1 C組及燒傷后小鼠不同時(shí)相點(diǎn)腸黏膜損傷指數(shù)比較（±s）

＊：P＜0.05，與B組比較；△：P＜0.05，與SC組同一時(shí)相點(diǎn)比較；－：表示無(wú)數(shù)據(jù)。

?

表2 C組及燒傷后小鼠不同時(shí)相點(diǎn)腸黏膜通透性變化比較（±s）

表2 C組及燒傷后小鼠不同時(shí)相點(diǎn)腸黏膜通透性變化比較（±s）

＊：P＜0.05，與B組同一時(shí)相點(diǎn)比較；△：P＜0.05，與SC組同一時(shí)相點(diǎn)比較；－：表示無(wú)數(shù)據(jù)。

組別0d 1 d 3 d 5 d 7 d B組－3.15±0.32 2.36±0.28 2.15±0.14 2.35±0.16 SC組－3.23±0.21 2.23±0.29 1.77±0.13＊1.72±0.14＊IG組－3.25±0.35 1.68±0.25＊1.35±0.12＊△1.17±0.16＊C組1.0－－－－△

表3 C組及燒傷后小鼠不同時(shí)相點(diǎn)血漿DAO活性變化比較（±s，U／mL）

表3 C組及燒傷后小鼠不同時(shí)相點(diǎn)血漿DAO活性變化比較（±s，U／mL）

＊：P＜0.05，與B組同一時(shí)相點(diǎn)比較；△：P＜0.05，與SC組同一時(shí)相點(diǎn)比較；－：表示無(wú)數(shù)據(jù)。

組別0d 1 d 3 d 5 d 7 d B組－1.88±0.32 1.73±0.19 1.43±0.17 0.98±0.12 SC組－1.75±0.28 1.59±0.22 1.12±0.16＊0.62±0.10＊IG組－1.92±0.20 1.45±0.16＊0.95±0.12＊△0.58±0.08＊△C組0.42±0.02－－－－

表4 C組及燒傷后小鼠不同時(shí)相點(diǎn)腸黏膜細(xì)胞增殖指數(shù)的變化（±s，%）

表4 C組及燒傷后小鼠不同時(shí)相點(diǎn)腸黏膜細(xì)胞增殖指數(shù)的變化（±s，%）

－：表示無(wú)數(shù)據(jù)。

組別0d 1 d 3 d 5 d 7 d B組－41.23±8.96 37.25±8.50 46.48±9.25 49.45±7.80 SC組－42.58±11.24 38.24±9.25 47.59±7.50 52.48±9.55 IG組－44.20±12.25 42.23±8.90 52.45±8.82 55.25±9.40 C組61.34±6.82－－－－

表5 C組及小鼠燒傷后不同時(shí)相點(diǎn)腸黏膜厚度比較（±s，μm）

表5 C組及小鼠燒傷后不同時(shí)相點(diǎn)腸黏膜厚度比較（±s，μm）

＊：P＜0.05，與B組同一時(shí)相點(diǎn)比較；△：P＜0.05，與SC組同一時(shí)相點(diǎn)比較；－：表示無(wú)數(shù)據(jù)。

組別0d 1 d 3 d 5 d 7 d B組－323.56±22.40 310.50±20.40 239.44±22.15 195.26±18.80 SC組－346.25±25.46 323.45±25.68 276.78±20.10＊252.45±21.15＊IG組－339.50±28.18 345.66±12.80 308.40±21.50＊△332.10±22.50＊△C組366.67±31.02－－－－

3 討 論

腸道是燒傷后缺血、缺氧性損害的主要靶器官之一，被譽(yù)為外科應(yīng)激的中心器官。燒傷后受損腸道的修復(fù)機(jī)制比較復(fù)雜，涉及腸上皮細(xì)胞增殖和移行等多個(gè)環(huán)節(jié)。生長(zhǎng)因子在腸道損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，在眾多生長(zhǎng)因子中，ITF似乎更具有特異性。首先ITF是腸道杯狀細(xì)胞特異分泌的小分子多肽，其他部位少見(jiàn)；其次，ITF具有特殊的“三葉草型”空間結(jié)構(gòu)，使之具備了蛋白酶消化抗性和酸堿穩(wěn)定性，使其能在胃腸道復(fù)雜的環(huán)境中不被破壞，保持生物活性[3]；此外，ITF空間結(jié)構(gòu)中的一些特殊位點(diǎn)還能同黏蛋白中的寡聚糖或多糖的側(cè)鏈相連，維護(hù)腸黏膜屏障[5]。因此，ITF被譽(yù)為胃腸道的“超級(jí)保護(hù)因子”。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，燒傷可導(dǎo)致腸道組織結(jié)構(gòu)受損，通透性增加，修復(fù)能力降低，黏膜萎縮。rhITF能顯著降低燒傷后腸道受損程度，SC組和IG組小鼠腸道損傷指數(shù)和血漿DAO活性明顯低于B組。與之對(duì)應(yīng)，腸黏膜通透性明顯下降，腸道萎縮程度也有所減輕，說(shuō)明rhITF具有較強(qiáng)的生物活性，能有效降低燒傷后腸道受損程度，減輕黏膜萎縮，降低腸黏膜通透性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，ITF促進(jìn)腸道修復(fù)的機(jī)制與細(xì)胞增殖無(wú)關(guān)，無(wú)論是灌胃還是皮下注射rhITF對(duì)燒傷后腸上皮細(xì)胞增殖受抑均無(wú)明顯療效，說(shuō)明ITF通過(guò)其他途徑促進(jìn)受損腸道修復(fù)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，ITF對(duì)細(xì)胞增殖活性影響不大，但能明顯促進(jìn)細(xì)胞移行[6]，本實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)ITF對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)效。增殖和移行是腸黏膜修復(fù)的主要方式，在受損腸道的修復(fù)中起重要作用，其中，細(xì)胞移行不涉及細(xì)胞DNA復(fù)制和蛋白合成，是腸黏膜的快速修復(fù)機(jī)制[7]，越來(lái)越受到重視。ITF主要通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞移行加快損傷黏膜的修復(fù)，而對(duì)細(xì)胞增殖能力影響不明顯，降低了使用生長(zhǎng)因子不當(dāng)造成的細(xì)胞過(guò)度增生，甚至發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)，較之其他生長(zhǎng)因子安全性更高，具有成為胃腸黏膜特異保護(hù)藥物的潛質(zhì)，值得重點(diǎn)研究和開(kāi)發(fā)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，無(wú)論哪種途徑給予rhITF對(duì)減輕燒傷后腸道損傷，維護(hù)腸黏膜屏障都有積極意義。相對(duì)而言，通過(guò)灌胃方式給藥的療效更佳，這可能與胃腸道直接給藥有利于維護(hù)腸黏膜屏障有關(guān)。ITF的空間結(jié)構(gòu)中有與黏蛋白中糖鏈結(jié)合的特異位點(diǎn)，能增加黏蛋白的穩(wěn)定性，能穩(wěn)定腸黏液層，減輕燒傷后腸道損傷，促進(jìn)黏膜修復(fù)[3]。此外，腸上皮細(xì)胞膜上具有ITF特異受體[8]，通過(guò)胃腸道給藥可能有利于ITF與其受體結(jié)合，啟動(dòng)腸道細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，促進(jìn)受損腸道修復(fù)，但其內(nèi)在的信號(hào)機(jī)制目前尚不甚清楚，有待進(jìn)一步研究。

總之，給予外源性ITF能有效減輕燒傷后腸道損傷，維護(hù)腸黏膜屏障，在沒(méi)有絕對(duì)口服用藥禁忌的情況下，應(yīng)優(yōu)先考慮通過(guò)胃腸道給藥。

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