鄭凌云 梁艷玲 梁靜文

（ 1 廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院生理學(xué)系，廣東，廣州 510006；2 中山大學(xué)中山眼科中心，廣東，廣州 510060）

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）增殖在糖尿病性血管并發(fā)癥中起關(guān)鍵作用[1]。高糖可誘導(dǎo)產(chǎn)生糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）。AGEs可刺激血管平滑肌細胞增殖并加速動脈粥樣硬化以及冠脈再狹窄形成[2]，提示AGEs在糖尿病血管并發(fā)癥中有重要作用。

氨基胍（aminoguanidine，AG）可阻止糖基化終末產(chǎn)物形成[3]，在糖尿病性動物模型中對血管損傷有保護作用，但其具有毒副效應(yīng)。因此尋找阻斷AGEs刺激血管平滑肌細胞增殖作用的藥物有重要臨床意義。

氯沙坦（losartan，LV）是血管緊張素受體1特異阻斷劑。高糖處理血管平滑肌細胞可上調(diào)該受體mRNA和平滑肌細胞增殖[4]，在II型糖尿病小鼠[5]中AT1受體阻斷劑可抑制ROS并改善主動脈的舒張功能，說明糖尿病引起的血管損傷與AT1受體活化密切相關(guān)。但氯沙坦對AGEs引起血管平滑肌細胞增殖的作用不明。本研究以果糖制備AGEs，觀察對大鼠腦基底動脈血管平滑肌細胞增殖的影響并探討氯沙坦對平滑肌細胞增殖的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

雄性SD大鼠（80～120g，合格證號0098406，中山大學(xué)實驗動物中心）；氯沙坦（純度≥98%，Sigma-Aldrich公司）；D-果糖（純度≥99%，上海生物工程有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco 公司）；CCK8試劑盒（上海同仁化學(xué)研究所）；DCF-DA（Sigma-Aldrich公司）； ERK1/2抗體（cell signaling technology公司）；細胞裂解液（millipore 公司）；牛血清白蛋白（純度≥98%，Sigma-Aldrich 公司）；β-actin抗體（boster bio-engineering technology）；ECL發(fā)光液（cell signaling technology 公司）。

1.2 糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的制備及鑒定

按文獻[6]用牛血清白蛋白（BSA；10mg/mL）在磷酸鉀緩沖液（200mmol/L，pH=7.4）中與D-果糖（250mmol/L）孵育。試劑用0.22μm濾膜過濾，37℃孵育6d。反應(yīng)產(chǎn)物用PBS透析48h除去未結(jié)合果糖。熒光分光光度儀測定產(chǎn)物熒光密度。蛋白濃度用BCA蛋白定量檢測。非糖化BSA用同樣方法制備，不加D-果糖。

1.3 腦基底動脈血管平滑肌細胞分離、培養(yǎng)和鑒定

斷頭取出大鼠腦基底動脈移入預(yù)冷PBS中，分離血管外膜后將其剪成1～3mm3小塊接種于細胞培養(yǎng)瓶，用含10%胎牛血清、100u/L青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)免疫熒光鑒定95%以上為平滑肌細胞。實驗用3～8代細胞。

1.4 血管平滑肌細胞增殖的檢測

取第四代平滑肌細胞以2×104個/孔加入96孔板待貼壁，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。分別以AGEs，氯沙坦（1，5，10μmol/L）+AGEs處理細胞44h后每孔加20 μL的WST-8繼續(xù)培養(yǎng)4h，酶聯(lián)免疫檢測儀（450nm）處測各孔OD值，每組設(shè)6個復(fù)孔。

1.5 平滑肌細胞中ROS檢測

細胞長到約70%匯合時用無血清培養(yǎng)基漂洗，加入10μmol/L的DCF-DA于37℃孵育30min。胰酶消化后懸于PBS中。用流式細胞儀在520nm檢測，激發(fā)光波長488nm。

1.6 免疫印跡檢測平滑肌細胞中ERK蛋白表達

取各皿細胞，加蛋白裂解液。冰上震蕩裂解30min后離心取上清，行SDS-PAGE 電泳。電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜，室溫封閉1h后孵育ERK1/2（1∶500）抗體4 ℃過夜，次日孵二抗室溫1 h，PBST 室溫洗脫。取發(fā)光底物溶液和增強劑溶液各0.25mL，加去離子水至5mL，暗室中使X 膠片感光。凝膠成像系統(tǒng)掃描分析灰度值，β-actin作為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

各組數(shù)據(jù)以 表示，組間采用單因素方差分析，用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血管平滑肌細胞的鑒定

培養(yǎng)1周后，可見細胞從組織塊中爬出向周圍擴展；約2周后出現(xiàn)典型的血管平滑肌細胞的“波峰波谷”狀生長。免疫熒光法鑒定胞內(nèi)α-smooth muscle actin表達陽性（圖1）。

圖1 A.培養(yǎng)1周后，平滑肌細胞從組織塊中爬出，成多角形，聚集分布（×100）；B陰性對照；C細胞內(nèi)α-SMC-actin抗原表達（×400）

2.2 AGEs和氯沙坦對血管平滑肌細胞增殖的作用

200mg/L的AGEs刺激48h后OD值與BSA組相比明顯增加（0.827±0.069 vs 0.364±0.052，P＜0.01）；BSA組與空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差別（P＞0.05）；氯沙坦（5，10μmol/L）和AGEs共同孵育48h后OD值顯著降低，且10μmol/L的氯沙坦抑制作用更明顯（0.827±0.069 vs 0.381±0.058，P＜0.01）。提示AGEs誘導(dǎo)的細胞增殖中有AT1的參與（表1）。

表1 不同濃度氯沙坦對AGEs誘導(dǎo)的腦血管平滑肌細胞增殖影響（±s，n=6）

表1 不同濃度氯沙坦對AGEs誘導(dǎo)的腦血管平滑肌細胞增殖影響（±s，n=6）

*P＜0.01 vs BSA對照組；#P＜0.01vs 1μmol/L氯沙坦+AGEs組；?P＜0.01 vs 5μmol/L氯沙坦+AGEs組

分組 CCK8值空白對照組（含0.1%胎牛血清）0.368±0.036 BSA對照組 0.364±0.052 AGEs組（200mg/L）0.827±0.069*1μmol/L氯沙坦+AGEs組 0.816±0.047*5μmol/L氯沙坦+AGEs組 0.658±0.064*#10μmol/L氯沙坦+AGEs組 0.381±0.058#?

2.3 氯沙坦對AGEs引起的細胞內(nèi)ROS生成的影響

流式細胞儀檢測DCF-DA熒光反應(yīng)胞內(nèi)ROS生成。AGEs處理48h，胞內(nèi)ROS較空白對照組增高（P＜0.01）；BSA組與空白對照組相比無顯著差別（P＞0.05）； 5μmol/L和10μmol/L氯沙坦可降低AGEs引起的ROS增多（P＜0.01），提示氯沙坦抑制AGEs誘導(dǎo)的細胞增殖與抑制ROS的生成有關(guān)（圖2）。

2.4 氯沙坦對AGEs引起的ERK1/2蛋白表達的影響

Western blot顯示，BSA不影響ERK1/2蛋白表達，給予AGEs處理血管平滑肌細胞48h后ERK1/2表達升高（P＜0.01），氯沙坦5和10μmol/L降低ERK1/2的表達。提示AGEs引起ERK1/2表達增高與AT1受體活化相關(guān)（圖3）。

3 討 論

糖尿病引起的動脈粥樣硬化是導(dǎo)致患者死亡的主要原因之一[7]。持續(xù)高糖可促進體內(nèi)AGEs形成[1]，進而參與糖尿病性血管疾病的發(fā)生。其中血管平滑肌細胞的異常增殖是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的關(guān)鍵[2]。

圖2 氯沙坦和AGEs對平滑肌細胞內(nèi)ROS生成的影響

圖3 氯沙坦對AGEs引起血管平滑肌細胞ERK1/2蛋白表達的影響

果糖結(jié)構(gòu)與葡萄糖相似，研究表明糖尿患者血清中果糖水平升高[8]；高果糖飲食還可使動物出現(xiàn)胰島素抵抗和血管舒張功能紊亂[9]，提示果糖在誘發(fā)心血管疾病中有重要作用。但果糖制備的AGEs是否具有生物活性目前報道不多。我們發(fā)現(xiàn)果糖制備的AGEs可刺激平滑肌細胞細胞增殖。

研究表明[10]ROS生成是AGEs誘導(dǎo)平滑肌細胞增殖的關(guān)鍵。我們發(fā)現(xiàn)果糖制備的AGEs明顯刺激細胞ROS生成，提示高果糖飲食對心血管損傷與AGEs生成有關(guān)；氯沙坦不僅抑制AGEs誘導(dǎo)的增殖且降低胞內(nèi)ROS，提示AGEs對血管平滑肌細胞的損傷與AT1受體活化有關(guān)；ERK1/2表達在AGEs刺激后明顯增高而氯沙坦可抑制其表達，說明果糖制備AGEs可能通過誘導(dǎo)AT1受體活化而引起ERK1/2蛋白表達來調(diào)控細胞增殖。

總之，果糖制備的AGEs同樣可引起血管平滑肌細胞增殖，其機制與AT1受體活化引起ROS生成和ERK1/2表達升高有關(guān)。但還需對相關(guān)分子機制做深入研究。

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