王旭菲 熊麗紅 黃麗紅

（1 江西省婦幼保健院，江西 南昌 330008；2 江西省血液中心，江西 南昌 330077）

ELISA試劑盒從操作方法和反應原理上區(qū)分有兩種：一步法和二步法，由于一步法少了1次洗板及孵育過程，節(jié)省了時間，得到廣泛應用。但在實際工作中發(fā)現(xiàn)ELISA一步法鉤狀效應明顯[1-3]，易造成漏檢現(xiàn)象。衛(wèi)生部要求自2010年10月1日起執(zhí)行《中華人民共和國藥典（2010年版）》后，試劑模式變更為二步法。2011年3月本中心ELISA檢測全由一步法改為二步法?，F(xiàn)結合NAT（核酸）檢測HBV-DNA結果將ELISA檢測HBsAg由一步法改二步法結果比較報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本血液中心2010年9月至2011年2月無償獻血者血液標本33483人份（采用2種試劑廠家ELISA一步法檢測和NAT檢測）；2011年4月至9月無償獻血者血液標本35064人份（采用2種試劑廠家ELISA二步法檢測和NAT檢測）。獻血者體檢均符合衛(wèi)生部《獻血者健康檢查要求》，并經(jīng)硫酸銅比重法篩查血紅蛋白、乙型肝炎金標試紙條篩查HBsAg均合格后抽取血樣，分離血漿備用。ELISA檢測用EDTA-K2抗凝國產(chǎn)試管，NAT檢測用美國BD公司帶分離膠試管。

1.2 試劑與儀器

HBsAg ELISA試劑盒為試劑A（北京金豪生物制品有限公司，HBV-JH）和試劑B（廈門新創(chuàng)生物制品有限公司，HBV-XC），NAT檢測試劑為cobas TaqScreen MPX HBV/HCV/HIV聯(lián)合檢測試劑（美國羅氏診斷公司定性檢測試劑）。HIMILTON STAR加樣儀（瑞士哈美頓公司）；FAME全自動酶免分析儀（瑞士哈美頓公司）；核酸檢測平臺（美國羅氏診斷公司）：HIMILTON STAR IVD標本混樣儀（瑞士哈美頓公司），cobas AmpliPrep核酸提取儀與cobas TaqMan分析儀通過混樣和數(shù)據(jù)管理服務器（PDM）連接組成平臺（簡稱CAP/CTM）。

1.3 方法

1.3.1 ELISA方法

將抗凝血液標本室溫離心后，用HIMILTON STAR加樣儀自動加樣，F(xiàn)AME全自動酶免分析儀檢測，過程嚴格按照試劑盒說明書操作，結果以吸光度值＞80% CUT-OFF值判定為陽性。

1.3.2 NAT方法

2種廠家ELISA試劑檢測HBsAg均陽性不做核酸檢測。核酸定性檢測采用cobas TaqScreen MPX方法，按試劑說明書HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA-1最低檢測限95%可信度分別是3.7IU/mL、10.7IU/mL、49IU/mL。

1.3.2.1 混樣檢測每6份標本各取166.7μL血漿匯集成1份1mL混樣標本，在cobass 201平臺使用cobas TaqScreen MPX試劑進行檢測，如果6份標本組成的pool檢測結果為非反應性，則該批標本檢測完成；如果pool檢測結果為反應性，則將組成pool的6份標本進行拆分單檢。

1.3.2.2 拆分單檢對組成pool的6份標本進行單個檢測，每個標本取1mL血漿在cobass 201平臺進行NAT，如某1個/若干個標本單檢結果為反應性，則進一步進行核酸鑒別檢測；如單檢結果為非反應性，則將原pool的反應性結果視為假陽性，即6個標本均為核酸檢測無反應性。

1.3.2.3 質(zhì)量控制按照cobas TaqScreen MPX test試劑盒說明書中步驟檢測。每組試驗均設置1個陰性對照和5個陽性對照，要求陰性對照沒有擴增信號，陽性對照檢測值均在相應的范圍內(nèi)，任何1個對照不符，本輪試驗結果無效。對于每個標本，按照說明書描述的結果判定原則報告檢測結果如下：①標本檢測結果為陽性時，無論內(nèi)參檢測結果是陰性還是陽性，標本檢測結果均報告為陽性；②標本檢測結果為陰性時分2種情況：內(nèi)參檢測結果為陽性，標本檢測結果報告為陰性；內(nèi)參檢測結果為陰性，該標本本次實驗無效，需要重試。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用STATA7.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，使用卡方檢驗方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

表1 ELISA一步法和二步法檢測結果比較

2.1 ELISA一步法和二步法檢測結果比較，見表1。結果顯示一步法與二步法檢測結果有明顯的統(tǒng)計學差異，二步法陽性率明顯高于一步法。

2.2 同種試劑廠家一步法和二步法檢測結果比較，見表2。HBV-JH及HBV-XC 2種廠家試劑二步法陽性率均明顯高于一步法。

表2 同種試劑廠家一步法和二步法檢測結果比較

表3 一步法和二步法2種不同試劑廠家結果比較

2.3 一步法和二步法2種不同試劑廠家結果比較，見表3。結果顯示北京金豪和廈門新創(chuàng)2種試劑廠家一步法，檢測結果無明顯差異；二步法有明顯差異，提示2種試劑廠家由一步法改二步法后檢測結果不相符現(xiàn)象明顯。

2.4 一步法和二步法雙試劑陽性結果比較，見表4。結果提示二步法雙試劑陽性率明顯高于一步法。

表4 一步法和二步法雙試劑陽性結果比較

2.5 同種試劑廠家一步法和二步法單一試劑陽性（即單獨一種試劑廠家檢測出陽性）結果比較，見表5。結果提示，北京金豪和廈門新創(chuàng)兩試劑廠家一步法和二步法單試劑陽性均有統(tǒng)計學差異，不過北京金豪由一步法改二步法后單試劑陽性越來越高，廈門新創(chuàng)由一步法改二步法后單試劑陽性越來越低。

表5 同種試劑廠家一步法和二步法單一試劑陽性結果比較

2.6 通過ELISA剔除雙試劑陽性標本后進行NAT檢測，由一步法改二步法后NAT陽性結

果比較，見表6。經(jīng)二步法剔除雙試劑陽性標本后進行NAT檢測陽性率明顯低于一步法剔除雙試劑陽性標本的NAT陽性率。

表6 一步法和二步法剔除雙試劑陽性后NAT結果比較

3 討 論

目前，對ELISA一步法和二步法結果比較已有不少報道，但都有針對性，有的考慮溶血單因素影響[4,5]，有的主要考慮鉤狀效應的研究[6,7]，均未納入大批量標本的檢測，缺乏綜合性分析。本研究綜合分析33483份經(jīng)一步法檢測和35064份經(jīng)二步法檢測，并對非雙試劑陽性的標本進行NAT檢測后結果進行了分析比較。

我們通過統(tǒng)計2010年9月至2011年2月無償獻血者血液標本33483人份（采用ELISA一步法和NAT檢測）和2011年4月至9月無償獻血者血液標本35064人份（采用ELISA二步法和NAT檢測）結果，提示二步法陽性率明顯高于一步法，通過NAT檢測發(fā)現(xiàn)單試劑陽性95%均為假陽性；一步法2種試劑廠家檢測結果無明顯差異，改二步法后2種試劑廠家檢測結果出現(xiàn)明顯差異提示在試劑方法改變過程中不同廠家試劑質(zhì)量出現(xiàn)了較大差異。

經(jīng)二步法剔除雙試劑陽性標本后進行NAT檢測陽性率明顯低于一步法剔除雙試劑陽性標本后的NAT陽性率，提示HBsAg漏檢得到一定控制，ELISA由一步法改為二步法后進一步減少了經(jīng)輸血傳播乙型肝炎病毒的發(fā)生。

研究表明ELISA一步法鉤狀效應明顯[1-3]，HBsAg＞2.6×105ng/mL時即可能產(chǎn)生鉤狀效應[8]。通過衛(wèi)生部反饋本中心NAT陽性標本HBsAg定量檢測結果發(fā)現(xiàn)，2010年9月至2011年2月和2011年4月至9月見均未發(fā)現(xiàn)可能引起鉤狀效應的高濃度HBsAg標本，可能由于無償獻血者獻血前經(jīng)過體檢咨詢和ALT、HBsAg快速初篩，基本由健康人群中采集血液。

為保證臨床用血安全盡量避免HBsAg的漏檢是大家追求的共同目標，國家也積極推廣核酸檢測，不過最大限度降低由假陽性反應導致的血液不合理淘汰和資源浪費也是應該考慮的因素，這就要求各試劑廠家在強調(diào)ELISA血液篩查試劑檢測靈敏度的同時，積極改善其檢測特異性，減少假陽性避免血液不必要浪費。

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