王旭菲 熊麗紅 黃麗紅

（1 江西省婦幼保健院，江西 南昌 330008；2 江西省血液中心，江西 南昌 330077）

ELISA試劑盒從操作方法和反應(yīng)原理上區(qū)分有兩種：一步法和二步法，由于一步法少了1次洗板及孵育過程，節(jié)省了時(shí)間，得到廣泛應(yīng)用。但在實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)ELISA一步法鉤狀效應(yīng)明顯[1-3]，易造成漏檢現(xiàn)象。衛(wèi)生部要求自2010年10月1日起執(zhí)行《中華人民共和國(guó)藥典（2010年版）》后，試劑模式變更為二步法。2011年3月本中心ELISA檢測(cè)全由一步法改為二步法?，F(xiàn)結(jié)合NAT（核酸）檢測(cè)HBV-DNA結(jié)果將ELISA檢測(cè)HBsAg由一步法改二步法結(jié)果比較報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本血液中心2010年9月至2011年2月無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本33483人份（采用2種試劑廠家ELISA一步法檢測(cè)和NAT檢測(cè)）；2011年4月至9月無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本35064人份（采用2種試劑廠家ELISA二步法檢測(cè)和NAT檢測(cè)）。獻(xiàn)血者體檢均符合衛(wèi)生部《獻(xiàn)血者健康檢查要求》，并經(jīng)硫酸銅比重法篩查血紅蛋白、乙型肝炎金標(biāo)試紙條篩查HBsAg均合格后抽取血樣，分離血漿備用。ELISA檢測(cè)用EDTA-K2抗凝國(guó)產(chǎn)試管，NAT檢測(cè)用美國(guó)BD公司帶分離膠試管。

1.2 試劑與儀器

HBsAg ELISA試劑盒為試劑A（北京金豪生物制品有限公司，HBV-JH）和試劑B（廈門新創(chuàng)生物制品有限公司，HBV-XC），NAT檢測(cè)試劑為cobas TaqScreen MPX HBV/HCV/HIV聯(lián)合檢測(cè)試劑（美國(guó)羅氏診斷公司定性檢測(cè)試劑）。HIMILTON STAR加樣儀（瑞士哈美頓公司）；FAME全自動(dòng)酶免分析儀（瑞士哈美頓公司）；核酸檢測(cè)平臺(tái)（美國(guó)羅氏診斷公司）：HIMILTON STAR IVD標(biāo)本混樣儀（瑞士哈美頓公司），cobas AmpliPrep核酸提取儀與cobas TaqMan分析儀通過混樣和數(shù)據(jù)管理服務(wù)器（PDM）連接組成平臺(tái)（簡(jiǎn)稱CAP/CTM）。

1.3 方法

1.3.1 ELISA方法

將抗凝血液標(biāo)本室溫離心后，用HIMILTON STAR加樣儀自動(dòng)加樣，F(xiàn)AME全自動(dòng)酶免分析儀檢測(cè)，過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，結(jié)果以吸光度值＞80% CUT-OFF值判定為陽(yáng)性。

1.3.2 NAT方法

2種廠家ELISA試劑檢測(cè)HBsAg均陽(yáng)性不做核酸檢測(cè)。核酸定性檢測(cè)采用cobas TaqScreen MPX方法，按試劑說明書HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA-1最低檢測(cè)限95%可信度分別是3.7IU/mL、10.7IU/mL、49IU/mL。

1.3.2.1 混樣檢測(cè)每6份標(biāo)本各取166.7μL血漿匯集成1份1mL混樣標(biāo)本，在cobass 201平臺(tái)使用cobas TaqScreen MPX試劑進(jìn)行檢測(cè)，如果6份標(biāo)本組成的pool檢測(cè)結(jié)果為非反應(yīng)性，則該批標(biāo)本檢測(cè)完成；如果pool檢測(cè)結(jié)果為反應(yīng)性，則將組成pool的6份標(biāo)本進(jìn)行拆分單檢。

1.3.2.2 拆分單檢對(duì)組成pool的6份標(biāo)本進(jìn)行單個(gè)檢測(cè)，每個(gè)標(biāo)本取1mL血漿在cobass 201平臺(tái)進(jìn)行NAT，如某1個(gè)/若干個(gè)標(biāo)本單檢結(jié)果為反應(yīng)性，則進(jìn)一步進(jìn)行核酸鑒別檢測(cè)；如單檢結(jié)果為非反應(yīng)性，則將原pool的反應(yīng)性結(jié)果視為假陽(yáng)性，即6個(gè)標(biāo)本均為核酸檢測(cè)無反應(yīng)性。

1.3.2.3 質(zhì)量控制按照cobas TaqScreen MPX test試劑盒說明書中步驟檢測(cè)。每組試驗(yàn)均設(shè)置1個(gè)陰性對(duì)照和5個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，要求陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增信號(hào)，陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)值均在相應(yīng)的范圍內(nèi)，任何1個(gè)對(duì)照不符，本輪試驗(yàn)結(jié)果無效。對(duì)于每個(gè)標(biāo)本，按照說明書描述的結(jié)果判定原則報(bào)告檢測(cè)結(jié)果如下：①標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，無論內(nèi)參檢測(cè)結(jié)果是陰性還是陽(yáng)性，標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果均報(bào)告為陽(yáng)性；②標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)分2種情況：內(nèi)參檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果報(bào)告為陰性；內(nèi)參檢測(cè)結(jié)果為陰性，該標(biāo)本本次實(shí)驗(yàn)無效，需要重試。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用STATA7.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用卡方檢驗(yàn)方法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

表1 ELISA一步法和二步法檢測(cè)結(jié)果比較

2.1 ELISA一步法和二步法檢測(cè)結(jié)果比較，見表1。結(jié)果顯示一步法與二步法檢測(cè)結(jié)果有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，二步法陽(yáng)性率明顯高于一步法。

2.2 同種試劑廠家一步法和二步法檢測(cè)結(jié)果比較，見表2。HBV-JH及HBV-XC 2種廠家試劑二步法陽(yáng)性率均明顯高于一步法。

表2 同種試劑廠家一步法和二步法檢測(cè)結(jié)果比較

表3 一步法和二步法2種不同試劑廠家結(jié)果比較

2.3 一步法和二步法2種不同試劑廠家結(jié)果比較，見表3。結(jié)果顯示北京金豪和廈門新創(chuàng)2種試劑廠家一步法，檢測(cè)結(jié)果無明顯差異；二步法有明顯差異，提示2種試劑廠家由一步法改二步法后檢測(cè)結(jié)果不相符現(xiàn)象明顯。

2.4 一步法和二步法雙試劑陽(yáng)性結(jié)果比較，見表4。結(jié)果提示二步法雙試劑陽(yáng)性率明顯高于一步法。

表4 一步法和二步法雙試劑陽(yáng)性結(jié)果比較

2.5 同種試劑廠家一步法和二步法單一試劑陽(yáng)性（即單獨(dú)一種試劑廠家檢測(cè)出陽(yáng)性）結(jié)果比較，見表5。結(jié)果提示，北京金豪和廈門新創(chuàng)兩試劑廠家一步法和二步法單試劑陽(yáng)性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不過北京金豪由一步法改二步法后單試劑陽(yáng)性越來越高，廈門新創(chuàng)由一步法改二步法后單試劑陽(yáng)性越來越低。

表5 同種試劑廠家一步法和二步法單一試劑陽(yáng)性結(jié)果比較

2.6 通過ELISA剔除雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本后進(jìn)行NAT檢測(cè)，由一步法改二步法后NAT陽(yáng)性結(jié)

果比較，見表6。經(jīng)二步法剔除雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本后進(jìn)行NAT檢測(cè)陽(yáng)性率明顯低于一步法剔除雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本的NAT陽(yáng)性率。

表6 一步法和二步法剔除雙試劑陽(yáng)性后NAT結(jié)果比較

3 討 論

目前，對(duì)ELISA一步法和二步法結(jié)果比較已有不少報(bào)道，但都有針對(duì)性，有的考慮溶血單因素影響[4,5]，有的主要考慮鉤狀效應(yīng)的研究[6,7]，均未納入大批量標(biāo)本的檢測(cè)，缺乏綜合性分析。本研究綜合分析33483份經(jīng)一步法檢測(cè)和35064份經(jīng)二步法檢測(cè)，并對(duì)非雙試劑陽(yáng)性的標(biāo)本進(jìn)行NAT檢測(cè)后結(jié)果進(jìn)行了分析比較。

我們通過統(tǒng)計(jì)2010年9月至2011年2月無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本33483人份（采用ELISA一步法和NAT檢測(cè)）和2011年4月至9月無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本35064人份（采用ELISA二步法和NAT檢測(cè)）結(jié)果，提示二步法陽(yáng)性率明顯高于一步法，通過NAT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單試劑陽(yáng)性95%均為假陽(yáng)性；一步法2種試劑廠家檢測(cè)結(jié)果無明顯差異，改二步法后2種試劑廠家檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)明顯差異提示在試劑方法改變過程中不同廠家試劑質(zhì)量出現(xiàn)了較大差異。

經(jīng)二步法剔除雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本后進(jìn)行NAT檢測(cè)陽(yáng)性率明顯低于一步法剔除雙試劑陽(yáng)性標(biāo)本后的NAT陽(yáng)性率，提示HBsAg漏檢得到一定控制，ELISA由一步法改為二步法后進(jìn)一步減少了經(jīng)輸血傳播乙型肝炎病毒的發(fā)生。

研究表明ELISA一步法鉤狀效應(yīng)明顯[1-3]，HBsAg＞2.6×105ng/mL時(shí)即可能產(chǎn)生鉤狀效應(yīng)[8]。通過衛(wèi)生部反饋本中心NAT陽(yáng)性標(biāo)本HBsAg定量檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2010年9月至2011年2月和2011年4月至9月見均未發(fā)現(xiàn)可能引起鉤狀效應(yīng)的高濃度HBsAg標(biāo)本，可能由于無償獻(xiàn)血者獻(xiàn)血前經(jīng)過體檢咨詢和ALT、HBsAg快速初篩，基本由健康人群中采集血液。

為保證臨床用血安全盡量避免HBsAg的漏檢是大家追求的共同目標(biāo)，國(guó)家也積極推廣核酸檢測(cè)，不過最大限度降低由假陽(yáng)性反應(yīng)導(dǎo)致的血液不合理淘汰和資源浪費(fèi)也是應(yīng)該考慮的因素，這就要求各試劑廠家在強(qiáng)調(diào)ELISA血液篩查試劑檢測(cè)靈敏度的同時(shí)，積極改善其檢測(cè)特異性，減少假陽(yáng)性避免血液不必要浪費(fèi)。

[1]賴雄,吳兆勇,余岸松.高含量HBsAg致ELISA一步法假陰性的探討[J].吉林醫(yī)學(xué),2007,28(7):879-880.

[2]馮健亮,陸典瑞,李啟輝.抗HIV(1/2)ELISA一步法檢測(cè)時(shí)應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)[J].中國(guó)輸血雜志,2003,16(4):265-266.

[3]張京豫,譚愛國(guó),郭健.TP-ELISA一步法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體鉤狀現(xiàn)象研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(11):1520-1523.

[4]薛俊太,鄧翠華,王惟等.溶血標(biāo)本在EL ISA 一步法和二步法中對(duì)HBVM測(cè)定結(jié)果的影響[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2009,6(14):1126-1127.

[5]馬良艷,王秋實(shí),王殿昌.ELISA一步法與二步法在HBsAg檢測(cè)的應(yīng)用比較[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程,2011,19(10):92-93.

[6]張文利,劉月芳.ELISA一步法與二步法及放免法對(duì)HBsAg檢測(cè)結(jié)果分析[J].中國(guó)公共衛(wèi)生,2000,16(8):756.

[7]顧志冬,吳倩文,馮曉靜,等.用于國(guó)產(chǎn)一步法HBsAg ELISA試劑及確認(rèn)試驗(yàn)試劑的改進(jìn)方法[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,26(1):32-35.

[8]陳遠(yuǎn)林,秦立新,張仁生.ELISA一步法HBeAg陽(yáng)性HBsAg 陰性標(biāo)本的分析[J].臨床檢驗(yàn)雜志,2004,2(1):45.