李祥華，高 林，余萬(wàn)桂，黃江榮 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

張家均 (長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 荊州 434000)

許甲鳳，杜亞明 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

粉防己堿對(duì)雄黃所致小鼠免疫功能低下的影響

李祥華，高 林，余萬(wàn)桂，黃江榮 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

張家均 (長(zhǎng)江大學(xué)附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北 荊州 434000)

許甲鳳，杜亞明 (長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：探討雄黃中毒所致小鼠免疫功能低下后粉防己堿(Tet)的調(diào)節(jié)作用。方法：取小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，粉防己堿(tetrandrine，Tet)高、中、低劑量組，二巰基丙磺酸鈉(DMPS)組。正常對(duì)照組給予生理鹽水，模型組灌胃給予70mg/kg雄黃混液，Tet高、中、低劑量組分別腹腔注射給予Tet 98.0、49.0、24.5mg/kg，連續(xù)42d。采用重量法稱量小鼠脾臟和胸腺質(zhì)量，以其質(zhì)量與體質(zhì)量之比作為胸腺和脾臟指數(shù)。Giemsa染色計(jì)數(shù)腹腔巨噬細(xì)胞(PMΦ)并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。用比色法測(cè)定紅細(xì)胞(RBC)裂解釋放的空斑形成細(xì)胞(PFC)量。觀察Giemsa染色后淋巴細(xì)胞個(gè)數(shù)并計(jì)算母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。結(jié)果：Tet能增加小鼠脾臟和胸腺的重量，增強(qiáng)小鼠PMΦ的吞噬能力(Plt;0.01)，提高小鼠溶血值，增加PFC數(shù)(Plt;0.01)，能提高小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率(Plt;0.01)，且有一定劑量差異。結(jié)論：對(duì)于雄黃所致的小鼠免疫功能低下，Tet的免疫增強(qiáng)作用可能是能使胸腺和脾臟重量增加，PMΦ的吞噬能力增強(qiáng)，淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率升高及抗體能力加強(qiáng)等作用有關(guān)。

粉防己堿；雄黃；免疫調(diào)節(jié)劑

近年來(lái)，隨著人們對(duì)雄黃及雄黃復(fù)方的深入研究和廣泛的臨床應(yīng)用，雄黃受到廣泛關(guān)注。但臨床常有雄黃中毒甚至死亡的報(bào)道。雄黃中毒的反應(yīng)是多方面的，其表現(xiàn)為：影響蛋白質(zhì)酶的活性，損害神經(jīng)，影響脂質(zhì)過(guò)氧化物代謝，損傷組織器官，影響免疫功能，引起免疫力下降。此外，損害細(xì)胞染色體，阻止細(xì)胞正常分裂，麻痹血管平滑肌。前人有用粉防己治療其中毒，解除其毒性的報(bào)道。前期的研究作用表明，粉防己堿(Tetrandrine，Tet)對(duì)雄黃中毒動(dòng)物有促進(jìn)砷排泄作用[1]。作者以Tet作為解毒劑，對(duì)其免疫增強(qiáng)作用進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)藥物 Tet為江西銀濤制藥有限公司產(chǎn)品。雄黃購(gòu)自湖北省荊州市中藥材公司，經(jīng)荊州市藥品檢驗(yàn)所劉以民副主任藥師鑒定為產(chǎn)于湖南的雄黃正品。二巰基丙磺酸鈉(DMPS)注射液(上海天豐藥廠)，批號(hào)021201。

1.1.2動(dòng)物 清潔級(jí)小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(鄂)2004-0028。

1.1.3試劑 Giemsa.染液、淋巴細(xì)胞分離液，上?；瘜W(xué)試劑廠，批號(hào) 070713；PRMI-1640、植物血凝素(PHA)，Sigma公司(美國(guó))，批號(hào) 3305RB560；L-谷氨酰胺，上海東風(fēng)化學(xué)試劑廠，批號(hào)0511143；小牛血清，杭州四季青生物工程公司，批號(hào)20070506。

1.1.4儀器 ThermoLabsystems Multisken M3 型酶標(biāo)儀，芬蘭；LD4-2A型低速離心機(jī)，北京離心機(jī)廠；765C型分光光度計(jì)，上海分析儀器廠；Leica DMLB2型光學(xué)顯微鏡，德國(guó)；PG3022型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，華東電子管廠。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 取小鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，雄黃(模型)組，模型+Tet高、中、低劑量組，模型+DMPS組，每組20只。

1.2.2給藥方法 除正常對(duì)照組外，各組每鼠每日上午ig給予雄黃70mg/kg，連續(xù)6周，實(shí)驗(yàn)期間，普通飼料喂養(yǎng)。中午12時(shí)停食不停水，下午18時(shí)Tet高、中、低劑量組分別ip給予98.0、49.0、24.5mg/kg的Tet注射液；DMPS組ip 7mg/kg的DMPS注射液。給藥6d后停藥1d為1個(gè)周期，連續(xù)6個(gè)周期。正常對(duì)照組給予同樣量的生理鹽水同法處理。

1.2.3小鼠免疫器官指數(shù)的測(cè)算 于給藥的最后一天，頸椎脫臼處死動(dòng)物，剖腹，立即取脾臟、胸腺稱重，按文獻(xiàn)[2]方法計(jì)算每組動(dòng)物器官指數(shù)。

1.2.4小鼠PMΦ吞噬功能的測(cè)定 于給藥的最后一天，按文獻(xiàn)[2]方法每鼠ip 10%蛋白胨0.2ml，32h后ip新鮮雞RBC 0.5ml，30min后處死動(dòng)物，立即剖腹，洗出腹腔液，37℃溫育15min 后離心，取細(xì)胞懸液涂片，甲醇固定，Giemsa染色后在油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)MΦ。以MΦ吞噬雞 RBC 的吞噬百分?jǐn)?shù)和吞噬指數(shù)為指標(biāo)表示藥物對(duì)小鼠PMΦ吞噬功能的影響。

1.2.5小鼠空斑形成細(xì)胞(PFC)量的測(cè)定 于給藥的最后一天, 按方法[3]每鼠ip 5% SRBC 0.2ml，4d 后放血致死，取脾臟，制成脾細(xì)胞懸液 ( 約5×106個(gè)/ml )。取該懸液0.5ml，加入0.2% SRBC和1∶10 小鼠血清各0.5ml，混勻。另設(shè)不加補(bǔ)體作為空白對(duì)照，37℃ 溫育1h 后離心，取上清液比色(波長(zhǎng)r=413nm)，測(cè)定 RBC裂解釋放的PFC量 ( 以D143值表示 )。

1.2.6小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)算 于停藥后的次日，小鼠眼球取血，肝素抗凝。參考文獻(xiàn)[3]方法，取血0.1ml加入1.8ml滅菌的PRMI-1640(內(nèi)含20%小牛血清，30.0g/L谷氨酰胺1.0ml)，再加入PHA 0.1ml，37℃溫育3d后吸出血清，加8.5g/L NH4Cl 4ml，混勻后37℃水浴10min，離心。取沉淀物滴加于玻片上，Giemsa染色液染色，油鏡下觀察200個(gè)淋巴細(xì)胞，計(jì)算其母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1Tet對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，試藥三個(gè)劑量組均可增加脾臟和胸腺指數(shù)，與正常對(duì)照組比較，高、中劑量組局均有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.01)；與模型組比較，高、中、低三個(gè)劑量組亦顯示非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.01)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 Tet對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

2.2Tet對(duì)小鼠PMΦ吞噬功能的影響

結(jié)果表明，Tet高、中、低三個(gè)劑量組均能提高PMΦ吞噬百分率和吞噬指數(shù)。與正常組比較，Tet高、中劑量組有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.01)，低劑量組也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.05)。與模型組比較，Tet高、中、低劑量組有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.01)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Tet對(duì)小鼠PMΦ吞噬功能的影響

2.3Tet對(duì)小鼠PFC的影響

結(jié)果表明，Tet各組均能提高小鼠溶血值，增加PFC數(shù)，與正常對(duì)照組比較，高劑量組有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.01)，中、低劑量組也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.05)。與模型組比較，高、中、低三個(gè)劑量組均有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.01)。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4Tet對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Tet不同劑量均能提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。與正常對(duì)照組比較，Tet高劑量組有非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Plt;0.01)；中、低劑量組也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均lt;0.05)。與模型組比較，Tet高、中、低三個(gè)劑量組也顯示出非常統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P均lt;0.01)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Tet對(duì)小鼠PFC的影響

表4 Tet對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

3 討 論

在上個(gè)世紀(jì)90年代，有人研究發(fā)現(xiàn)，Tet是一種天然的免疫抑制劑，對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫均有抑制作用。Tet可通過(guò)干擾細(xì)胞跨膜信號(hào)傳遞，抑制分裂原刺激淋巴細(xì)胞增殖、B細(xì)胞合成抗體及NK細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用。Tet還可通過(guò)下調(diào)T細(xì)胞蛋白激酶C信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制T細(xì)胞增殖，減少I(mǎi)L-2的分泌及下調(diào)T細(xì)胞激活抗原CD71的表達(dá)產(chǎn)生免疫均有抑制作用。Tet可劑量和時(shí)間依賴性的地引起小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、豚鼠肺巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞系J774細(xì)胞活性喪失，抑制巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)，減少氧自由基的生成，下調(diào)多種炎性細(xì)胞因子的合成與釋放[4]。亦可劑量依賴性抑制內(nèi)毒素、PMA及二氧化硅誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞NF-KB的激活及NF-KB依賴性基因的表達(dá)，但對(duì)核轉(zhuǎn)錄因子SP-1的DNA結(jié)合活性及SP-1依賴報(bào)告基因無(wú)影響，這一作用與抑制IKB降解的某些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、清除氧自由基有關(guān)[5]。Tet還可顯著抑制N-甲酰基蛋氨酸、亮氨酸等誘導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1表達(dá)上調(diào)、自由基聚集及對(duì)纖維蛋白原粘附[6]。Tet在體內(nèi)外均有較好的免疫抑制作用，且與抗風(fēng)濕藥物具有協(xié)同作用，還可減少不良反應(yīng)，但其機(jī)制不同于其他抗風(fēng)濕藥[7]。

雄黃中毒后，機(jī)體的免疫功能下降。我們研究發(fā)現(xiàn)，Tet在促進(jìn)雄黃中毒動(dòng)物砷排泄時(shí)，能調(diào)節(jié)其免疫功能。研究結(jié)果表明，給予Tet不同劑量時(shí)，能增加小鼠脾臟和胸腺指數(shù)，提高PMΦ吞噬百分率和吞噬指數(shù)，提高小鼠溶血值，增加PFC數(shù)，提高淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。這表明Tet在治療雄黃中毒時(shí)，能發(fā)揮其雙重作用。

[1]李祥華，高林，余萬(wàn)桂，等. 粉防己堿對(duì)雄黃中毒大鼠尿砷血砷含量的影響[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，29(24)：2083-2085.

[2] 李儀奎. 中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991：155.

[3] 徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 3版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1433-1456.

[4] Pang L, Hoult J R. Cytotoxicity to macrophages of tetrandrine, an antisilicosis alkaloid,accompanied by on overproduction of prostaglandins [J]. Biochem Pharmacol，1997，53(6)：773-779.

[5] Chen F，Lu Y，Demers L M，et al. Role of hydroxyl radical in silica-induced NF-kappa B activation in macrophages [J]. Ann Clin Lab Sci，1998，28(1)：1-8.

[6] Shen Y C，Chen C F，Wang S Y，et al. Impediment to calcium influx and reactive oxygen production accounts for the inhibition of neutrophil Mac-1 up-regulation and adhesion by tetrandrine [J]. Mol Pharmacol，1999，55(1)：186-191.

[7] Lai J H. Immunomodulatory effects and mechanism of plant alkaloid tetrandrine in autoimmune diseases [J]. Acta pharmacol Sin，2002，23(12)：1093-1099.

[編輯] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.01.001

R963

A

1673-1409(2012)01-R001-03

2011 10 25

湖北省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2006AA301C34)

李祥華(1953)，男，湖北松滋人，教授，主要從事中醫(yī)藥學(xué)教學(xué)與研究工作。