錢海洪，胡義德

順鉑與氯霉素聯(lián)用增強(qiáng)對人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用

錢海洪，胡義德

（昆明醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院腫瘤科，云南玉溪653100）

目的體外觀察順鉑和氯霉素對人肺腺癌A549細(xì)胞的相互作用。方法采用MTT法，利用中效原理判定聯(lián)合應(yīng)用順鉑及氯霉素對人肺腺癌A549細(xì)胞的效應(yīng)。結(jié)果順鉑與氯霉素聯(lián)用可以明顯抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的生長，兩藥單用和聯(lián)用時(shí)隨著藥物濃度增加，其效應(yīng)也增加；兩藥聯(lián)用時(shí)的中效濃度明顯小于兩藥單獨(dú)使用時(shí)的中效濃度（順鉑減少43.8%，氯霉素減少79.1%）；兩藥大劑量合用時(shí)為拮抗效應(yīng)（CI＞1），小劑量合用時(shí)為協(xié)同效應(yīng)（CI＜1）；并且兩藥合用時(shí)的效應(yīng)與給藥的時(shí)間先后次序無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論順鉑與氯霉素的聯(lián)用可以明顯抑制人肺腺癌A549細(xì)胞的生長，兩藥聯(lián)用時(shí)的中效濃度較單用時(shí)明顯減?。簧鲜鰞煞N藥合用時(shí)大劑量為拮抗，小劑量為協(xié)同；兩藥合用時(shí)的效應(yīng)與給藥的時(shí)間先后次序無關(guān)。

肺腺癌A549細(xì)胞；順鉑；氯霉素；中效原理；合用指數(shù)

腫瘤化療作為全身性治療的手段，它在治療中具有手術(shù)和放療不可替代的地位，傳統(tǒng)的化療藥物療效不高，毒副反應(yīng)較大。為了進(jìn)一步提高化療療效，我們在體外觀察用順鉑和氯霉素兩種藥物單用或合用時(shí)對人肺腺癌A549細(xì)胞的相互作用，并且采用Chou Talalay聯(lián)合指數(shù)法（即中效原理）[1]判斷兩種藥物相互作用的效果。

資料與方法

一、材料

1．細(xì)胞培養(yǎng)：人肺腺癌A549細(xì)胞系由中科院上海細(xì)胞生物研究所提供。用10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液（內(nèi)含0.11%青霉素、鏈霉素）培養(yǎng)細(xì)胞，并置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

2．藥物：注射用順鉑（Cisplatin，CDDP）使用時(shí)配制成終濃度為0.333、0.666、1.332、2.664和5.328μmol/L 5種濃度，氯霉素注射液（Chloramphenicol，CAP）使用時(shí)配制成終濃度為30.947、61.894、123.788、247.576和495.152μmol/L，5種濃度。

二、方法

1．用MTT法[2]檢測藥物效應(yīng)：將處于對數(shù)生長期的肺腺癌A549細(xì)胞制成1.5×104個(gè)細(xì)胞/ml的懸液，每孔200μl加入96孔培養(yǎng)板內(nèi)。實(shí)驗(yàn)設(shè)各種藥物濃度試驗(yàn)組及腫瘤細(xì)胞陰性對照組和空白組（每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔），將兩種單藥的5種不同濃度分別加入96孔板內(nèi)，每孔加藥量20μl，兩藥合用比例為1∶1方案，每孔加藥總量仍為20μl（每種單藥劑量濃縮1倍，各加10μl）。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3d，用TECAN自動酶標(biāo)儀測定OD490值。

2．兩藥合用時(shí)間先后次序依賴關(guān)系：實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)同時(shí)給藥組、先加CDDP24h后再加CAP組和先加CAP24h后再加CDDP組。培養(yǎng)3d MTT法測定OD490值。

3．結(jié)果判定方法：根據(jù)中效方程式fa/fu＝（D/Dm）m，兩邊取對數(shù)得lgfa/fu＝mlgD－mlgDm。設(shè)Y＝lgfa/fu，X＝lgD，a＝－mlgDm，b＝m，帶入上述方程式中得Y＝bX+a。其中fa為細(xì)胞抑制率＝1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對照組平均OD值；fu為細(xì)胞生存率＝實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對照組平均OD值；D為藥物濃度；Dm為中效濃度即IC50。再根據(jù)lgDm＝－a/b就可以算出兩種藥物單用及合用時(shí)各自的中效濃度Dm。然后可計(jì)算出兩藥合用時(shí)在各種效應(yīng)時(shí)的合用指數(shù)CI＝D1/Dx1+D2/Dx2+α（D1D2/Dx1Dx2），D1、D2為合用時(shí)產(chǎn)生X效應(yīng)時(shí)兩藥各自濃度，Dx1、Dx2為兩藥單獨(dú)使用時(shí)各自所需濃度，α＝0為兩種相互排斥性藥物，α＝1為兩種相互非排斥性藥物。CI＜1協(xié)同，CI=1相加，CI＞1拮抗[3]。

4．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS10.0進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、兩藥單用及合用時(shí)不同濃度的效應(yīng)兩種藥單用及合用時(shí)隨著藥物濃度增加其效應(yīng)也增加，見表1。按中效方程式計(jì)算m、Dm及γ，見表2。再計(jì)算出兩藥合用在不同效應(yīng)時(shí)的合用指數(shù)CI，進(jìn)而判斷兩藥在不同效應(yīng)時(shí)各自所需藥物濃度之間相互作用是協(xié)同、相加還是拮抗。因?yàn)镃DDP與CAP，2藥作用機(jī)理不同，α＝0。結(jié)果見表3；以效應(yīng)fa為橫坐標(biāo)，CI為縱坐標(biāo)作量效曲線，見附圖。

二、兩藥合用時(shí)間先后次序依賴關(guān)系，見表4。

討論

順鉑是治療肺癌中最常用的化療藥物之一，屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，主要作用靶點(diǎn)是增殖細(xì)胞的DNA，有類似烷化劑雙功能基團(tuán)的作用，可和細(xì)胞內(nèi)的堿基結(jié)合，使DNA分子鏈內(nèi)和鏈間交叉鍵聯(lián)，從而使DNA失去功能，不能復(fù)制；高濃度時(shí)也抑制DNA和蛋白質(zhì)的合成。順鉑除了與核DNA相互作用外，線粒體DNA（mtDNA）也是其重要的作用靶點(diǎn)。順鉑可引起肺腺癌A549細(xì)胞凋亡已被證實(shí)[4,5]，并且上一階段試驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)順鉑作用后肺腺癌A549細(xì)胞中細(xì)胞色素氧化酶亞單位Ⅰ（CoxⅠ）、核糖體12SrRNA基因以及半胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA-Cys）、天冬酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA-Asn）基因表達(dá)顯著上調(diào)，由此推測線粒體氧化磷酸化功能的增強(qiáng)是癌細(xì)胞對化療藥物的自然反應(yīng)過程[6]。氯霉素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理主要有以下幾個(gè)方面：①抑制線粒體蛋白質(zhì)的合成；氯霉素通過與線粒體核糖體的70S亞基相結(jié)合而抑制線粒體蛋白質(zhì)的合成，長時(shí)間的蛋白質(zhì)合成障礙會導(dǎo)致能量的匱乏，線粒體膜穩(wěn)定性的紊亂，最終引起凋亡[7]；②對線粒體呼吸鏈的影響，Douglas[8]經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明氯霉素可以明顯降低復(fù)合體IV的水平，而對復(fù)合體II/III幾乎沒有影響，從而抑制線粒體呼吸鏈的功能；③cyt-c增多，氯霉素可以使cyt-c的合成和釋放增加[9]，cyt-c的增加又可以誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。

在本實(shí)驗(yàn)中，從表1可以看出，順鉑和氯霉素單獨(dú)應(yīng)用和聯(lián)合應(yīng)用時(shí)隨著藥物濃度增加，其效應(yīng)也增加；這兩種藥在體外合用后，它們對肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用明顯加強(qiáng)，并且聯(lián)用時(shí)的中效濃度比單用時(shí)要小得多（見表2）。其中CDDP單用時(shí)Dm＝2.897μmol/L，合用時(shí)Dm＝1.629μmol/L，合用比單用時(shí)減少43.8%；CAP單用時(shí)Dm＝724.436μmol/L，合用時(shí)Dm＝151.462μmol/L，合用比單用時(shí)減少79.1%。這充分說明CDDP與CAP聯(lián)合用藥在體外對肺腺癌A549細(xì)胞只需小劑量就達(dá)到高效應(yīng)，同時(shí)也使藥物不良反應(yīng)減少。

從兩種藥物合用時(shí)的量效曲線也可以看出，當(dāng)效應(yīng)fa＝0.55時(shí)（即CDDP＝2.461μmol/L，CAP＝228.72μmol/L），其CI為1，說明兩種藥在該效應(yīng)時(shí)其相互作用為相加；當(dāng)fa＞0.55時(shí)（即CD-DP＞2.461μmol/L，CAP＞228.72μmol/L），CI＞1，為拮抗作用效應(yīng)；當(dāng)fa＜0.55時(shí)（即CDDP＜2.461μmol/L，CAP＜228.72μmol/L），CI＜1，為協(xié)同作用效應(yīng)。

表1 兩種藥物單用及合用時(shí)不同濃度（μmol/L）時(shí)的效應(yīng)（fa）

表2 兩種藥物單用及合用時(shí)的m、Dm及γ

表3 兩種藥物在不同濃度時(shí)的合用指數(shù)

附圖CDDP與CAP合用時(shí)的量效曲線

表4 兩藥合用時(shí)用藥時(shí)間先后次序依賴關(guān)系

從表4經(jīng)單因素方差分析結(jié)果為：F＝0.564，P＝0.583＞0.05，并認(rèn)為同時(shí)加藥組、先加CDDP組和后加CDDP組，3組間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異，也就是兩藥合用時(shí)的效應(yīng)與給藥的時(shí)間先后次序無關(guān)。

順鉑與氯霉素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，尤其是在藥物濃度較小時(shí)，對肺腺癌A549細(xì)胞具有協(xié)同殺傷作用，說明兩藥在聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其抑制肺腺癌A549細(xì)胞生長的效果要明顯強(qiáng)于單獨(dú)用藥，其作用機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。同時(shí)順鉑和氯霉素的聯(lián)合用藥也為腫瘤的臨床用藥開拓了新的思路，有望能進(jìn)一步提高化療療效和降低化療藥物的毒副作用，但要真正用于臨床還需要更多的相關(guān)研究。

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The interaction between cisplatin and chloramphenicol on human lung adenocarcinoma cell line A549.

QIAN Hai-hong,HU Yi-de
（Department of Oncology，Sixth Affiliated Hospital，Kunming Medical College，Yuxi,Yunnan 653100，China）

ObjectiveTo observe the interaction between cisplatin and chloramphenicol on human lung adenocarcinoma cell line A549.MethodsThe anticancer effect of the drugs was detected with MTT.The median-effect principle was used.ResultsThe combination of cisplatin and chloramphenicol significantly inhibited the growth of human lung adenocarcinoma cell line A549.Anticancer effects of the individual and combined drugs enhanced as drug concentration increased.The 50%inhibited concentration of each drugs in combination was lesser than the concentration of each individual drugs.(Cisplatin decreased of 43.8%,Chloramphenicol decreased of 79.1%).The combination of the two drugs at higher concentration the CI was more than 1,and the combinations at lower concentration the CI was less than 1.The sequence of administration did not influence the anticancer effects (P＞0.05).ConclusionThe combination of cisplatin and chloramphenicol significantly inhibited the growth of human lung adenocarcinoma cell line A549.The 50%inhibited concentration of each drugs in combination was lesser than the concentration of each individual drugs.The combined drugs interaction was antagonistic at higher concentration and synergistic at lower concentration.The sequence ofadministration did not influence the anticancer effects.

Lung adenocarcinoma cell line A549；Cisplatin；Chloramphenicol；Median-effect principle；Combination index

R734.2

A

1006-4141（2012）04-0346-04

2012－04－10

錢海洪（1974～）男，主治醫(yī)師，碩士生，主要從事腫瘤細(xì)胞線粒體功能干預(yù)對其化療敏感性進(jìn)行調(diào)控的研究工作。

胡義德，男，主任醫(yī)師，博士后，教授，碩士生導(dǎo)師。