邵維斌,朱 莉,顧 琳,夏春英,李 忻,荀 康,馮松濤

(江蘇省鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科,江蘇鎮(zhèn)江,212002)

腹膜纖維化和大量新生血管形成是導致長期腹膜透析患者腹膜功能衰竭的主要原因[1]。大量研究[2-3]表明:隨著腹膜透析的進行,非生理性透析液尤其是晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)、葡萄糖降解產(chǎn)物等可引起腹膜間皮細胞逐漸喪失上皮細胞表型,發(fā)生上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),這種發(fā)生EMT的腹膜間皮細胞具有浸潤和遷移的能力,是導致腹膜纖維化和新生血管形成的關鍵環(huán)節(jié)[4],防止和逆轉(zhuǎn)晚期糖基化終產(chǎn)物等引起的腹膜間皮細胞EMT對于防治長期腹膜透析患者腹膜功能衰竭具有重要意義。本研究探討防治晚期糖基化終產(chǎn)物引起的腹膜間皮細胞EMT的方法。

1 材料與方法

1.1 原代大鼠腹膜間皮細胞的培養(yǎng)

大鼠腹膜間皮細胞分離、培養(yǎng)及鑒定,腹膜間皮細胞呈圓形、橢圓形、多邊形等,融合后呈典型的鋪路石樣。免疫組化結果顯示細胞角蛋白、波形蛋白陽性。取第3代細胞進行實驗。

1.2 晚期糖基化終產(chǎn)物誘導大鼠腹膜間皮細胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化

第3代大鼠腹膜間皮細胞經(jīng)含80 mmol/L AGEs-BSA的M 199培養(yǎng)基培養(yǎng)72h[5],以含80 mmol/L BSA的M199培養(yǎng)基為對照,正常大鼠腹膜間皮細胞呈鋪路石狀,在晚期糖基化終產(chǎn)物作用72 h后細胞出現(xiàn)明顯的梭形或不規(guī)則形改變,似成纖維細胞,部分細胞出現(xiàn)互相交叉重疊現(xiàn)象。實時定量PCR(RT-PCR)檢測結果顯示,晚期糖基化終產(chǎn)物刺激后,大鼠腹膜間皮細胞α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)mRNA表達水平增加而E-cadherin mRNA表達水平下降;Western印跡結果顯示,晚期糖基化終產(chǎn)物刺激后,大鼠腹膜間皮細胞α-SMA蛋白表達水平增加,而 E-cadherin蛋白表達水平下降。與對照組及BSA組相比,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明晚期糖基化終產(chǎn)物誘導大鼠腹膜間皮細胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化。

1.3 分組

對照組,含80 mmol/L AGEs-BSA的M199培養(yǎng)基;5ng/mL骨形成蛋白-7(BMP-7)組,含5 ng/mL和80 mmol/L AGEs-BSA(晚期糖基化終產(chǎn)物牛血清白蛋白)的M199培養(yǎng)基;10 ng/mL BMP-7組,含10 ng/mL 和80 mmol/L AGEs-BSA的M199培養(yǎng)基;晚期糖基化終產(chǎn)物誘導上皮-間葉轉(zhuǎn)化的大鼠腹膜間皮細胞經(jīng)上述各組培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集細胞,分別提取 RNA、蛋白。

1.4 RT-PCR檢測 E-cadherin、α-SMA 、Ⅰ型膠原(Collagen I)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)mRNA的表達

細胞總RNA抽提按Trizol試劑盒的方法進行,運用RT-PCR試劑盒(德國Qiagen)檢測,反轉(zhuǎn)錄50℃20 min,E-cadherin 引物序列:正義鏈5′-ACCCCTGTTGGTGTCTTT-3′, 反義鏈 5′-TTCGGGCTTGTTGTCATTCT-3′。α-SMA 引物序列 :正義鏈 5′-GCTCTGTAAGGCGGGCTTTG-3′; 反義鏈5′-ACGAAGGAATAGCCACGCTCA-3′。CollagenI引物序列:正義鏈 5′-GGTAACGATGGTGCTGTCGG-3′, 反義鏈 5′-GGGACCTTGAACTCCAGCAG-3′。TGF-β1引物序列:正義鏈5′-CGAGGTGACCTGGGCACCATCC-3′,反義鏈 5′-CTGTGCTATTGCCTTGTC-3′。VEGF 引物序列:正義鏈 5′-TTACTGCTGTACCTCCAC-3′, 反義鏈5′-ACAGGACGGCTTGAAGATA-3′。 GAPDH 引物 序列:正義鏈 5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′, 反義鏈 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。 HotStarTaq DNA多聚酶激活95℃15 min,E-cadherin反應條件:94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45 s,35個連續(xù)循環(huán);-SMA反應條件:94℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸45 s,28個連續(xù)循環(huán);CollagenI反應條件:94℃變性30s,57℃退火30s,72℃延伸45 s,29個連續(xù)循環(huán)。TGF-β1反應條件:94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45 s,35個連續(xù)循環(huán)。VEGF反應條件:94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸45 s,40個連續(xù)循環(huán)。得出Ct值按公式2-△△Ct求出基因表達的相對變化量,然后進行各組間比較。

1.5 Western印跡法檢測E-cadherin、α-SMA蛋白的表達

裂解處理后的大鼠腹膜間皮細胞,4℃1000 r/min離心10 min后取裂解液上清測蛋白濃度,取細胞裂解蛋白(約 30 μg)經(jīng) SDS-PAGE凝膠電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,分別加入小鼠抗E-cadherin抗體(美國BD)、小鼠抗α-SMA抗體(丹麥,Dako)和小鼠抗β-actin抗體(美國CST)4℃過夜,洗膜后加辣根過氧化酶標記的大鼠抗小鼠IgG抗體(美國CST),37℃1.5 h,洗膜后加ECL試劑,X線自顯影顯示結果,分析光帶的吸光度。

1.6 ELISA法測定細胞培養(yǎng)液中TGF-β1和VEGF

大鼠腹膜間皮細胞分組干預48 h和72 h后,離心收集細胞上清液,按ELISA試劑盒說明檢測TGF-β1和VEGF蛋白水平。

2 結 果

2.1 RT-PCR檢測E-cadherin 、α-SMA 、CollagenI、TGF-β、VEGF mRNA 表達結果

BMP-7作用48 h后,上皮-間葉轉(zhuǎn)化的大鼠腹膜間皮細胞E-cadherin mRNA表達水平增加(圖 1),而 α-SMA 、Collagen I、TGF-β、VEGF mRNA表達水平下降(圖2～圖5)。與對照組相比,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 各組間皮細胞E-cadherin mRNA的相對表達量

圖2 各組間皮細胞α-SMA mRNA的相對表達量

2.2 Western印跡測定E-cadherin、α-SMA 表達結果

BMP-7作用48 h后,上皮-間葉轉(zhuǎn)化的大鼠腹膜間皮細胞E-cadherin蛋白表達水平增加(圖6),而α-SMA蛋白表達水平下降(圖7)。與對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖3 各組間皮細胞CollagenI mRNA的相對表達量

圖4 各組間皮細胞TGF-β1 mRNA的相對表達量

圖5 各組間皮細胞VEGF mRNA相對表達量

圖6 各組間皮細胞E-cadherin蛋白的相對表達量

圖7 各組間皮細胞α-SMA蛋白的相對表達量

2.3 ELISA 法測定TGF-β、VEGF蛋白表達水平

BMP-7作用48 h后,上皮-間葉轉(zhuǎn)化的大鼠腹膜間皮細胞TGF-β、VEGF蛋白表達水平下降(圖8～圖9),與對照組相比,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖8 各組間皮細胞TGF-β1蛋白的表達水平

圖9 各組間皮細胞VEGF蛋白的表達水平

3 討 論

腹膜透析是終末期腎功能衰竭的主要治療方法之一,已進入臨床30余年,隨著其裝置的不斷改進,在我國越來越多慢性腎衰患者開始腎替代治療時首選腹膜透析療法。但是隨著腹膜透析時間延長,由于非生理性透析液尤其是高濃度葡萄糖、葡萄糖降解產(chǎn)物、晚期糖基化終產(chǎn)物等可引起腹膜結構改變和腹膜功能衰竭,臨床上出現(xiàn)超濾失敗[6]。這是患者退出腹膜透析的主要原因之一,同時也制約了腹膜透析的應用和發(fā)展[7]。長期腹膜透析患者腹膜出現(xiàn)表層間皮細胞消失、大量新生血管形成及透明樣血管病變、纖維化等病理改變,腹膜纖維化和大量新生血管形成是導致腹膜功能衰竭的主要原因。最近的研究[1-3,8-9]發(fā)現(xiàn),隨著腹膜透析的進行,腹膜透析患者腹膜間皮細胞逐漸喪失上皮細胞表型,同時獲得肌纖維母細胞樣的特性,即發(fā)生上皮-間葉轉(zhuǎn)化。越來越多的證據(jù)表明[1,10],腹膜透析患者腹膜組織中肌纖維母細胞明顯增多,這種細胞具有合成細胞外基質(zhì)、細胞因子、生長因子及參與炎癥反應的能力等特性,在各種修復及纖維化過程中起重要作用。研究[11-13]證明上皮-間葉轉(zhuǎn)化在腎、肝、肺等器官纖維化中有重要的作用,本研究先前表明:高濃度葡萄糖能和晚期糖基化終產(chǎn)物誘導大鼠腹膜間皮細胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化[5,14],這種發(fā)生上皮-間葉轉(zhuǎn)化上調(diào)了 TGF-β、VEGF 的表達,而 TGF-β、VEGF在腹膜透析時腹膜纖維化和腹膜新生血管形成過程中起重要作用,提示間皮細胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化可能是導致腹膜透析時腹膜纖維化和新生血管形成的關鍵環(huán)節(jié)。因而尋求防治間皮細胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化的有效方法,具有重要的臨床意義。

本研究中探討B(tài)MP-7對晚期糖基化終產(chǎn)物誘導大鼠腹膜間皮細胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化的影響。體外研究發(fā)現(xiàn):BMP-7能上調(diào)上皮-間葉轉(zhuǎn)化的大鼠腹膜間皮細胞E-cadherin表達和下調(diào)α-SMA、Collagen I表達,表明BMP-7能逆轉(zhuǎn)晚期糖基化終產(chǎn)物誘導大鼠腹膜間皮細胞EMT。同時本研究還發(fā)現(xiàn)BMP-7能下調(diào)TGF-β、VEGF表達,而 TGF-β、VEGF在腹膜纖維化和腹膜新生血管形成過程中起重要作用。表明BMP-7可能具有防治腹膜透析時腹膜纖維化和腹膜新生血管形成作用。本研究結果為進一步探討防治腹膜透析時腹膜功能衰竭的有效方法提供依據(jù)。

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