李寶坤，田豐偉，劉小鳴，趙建新，張 灝，宋元達(dá)，陳 衛(wèi)，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122; 2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000)

冷脅迫對(duì)冷凍干燥羅伊氏乳酸桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

李寶坤1，2，田豐偉1，劉小鳴1，趙建新1，張 灝1，宋元達(dá)1，陳 衛(wèi)1，*

(1.江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122; 2.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000)

以DPH(1，6－二苯基－1，3，5－己三烯)為熒光探劑，優(yōu)化了測(cè)定羅伊氏乳酸桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的條件，其最佳測(cè)定條件為:激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)430nm，菌濃度OD 0.8，30℃孵育時(shí)間為20min。同時(shí)研究冷脅迫處理對(duì)冷凍干燥存活率。細(xì)胞活力及細(xì)胞膜流動(dòng)的影響，研究表明冷脅迫能改善乳酸菌的冷凍干燥存活率，同時(shí)在一定的條件下，凍干后細(xì)胞的流動(dòng)性也有所改變，說(shuō)明經(jīng)過(guò)一定的冷脅迫處理后，增加了細(xì)胞的抗性，從而提高細(xì)胞的冷凍存活率。

冷脅迫，羅伊氏乳酸桿菌，DPH，細(xì)胞膜流動(dòng)性，冷凍干燥

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri) 本實(shí)驗(yàn)室保存;培養(yǎng)基 MRS;1，6－二苯基－1，3，5－己三烯DPH，Aldrich公司;四氫呋喃、其他試劑 均為分析純。

650－60熒光分光光度計(jì) 日本，日立有限公司;冷凍干燥機(jī) 美國(guó)，LABCONCO有限公司;2450紫外－可見(jiàn)光分光光度計(jì) 島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脅迫處理 菌體培養(yǎng)18h(穩(wěn)定前期)后，經(jīng)過(guò)離心濃縮，加入15%蔗糖(w/v)作為保護(hù)劑，分裝為9份，其中1份立即在－80℃預(yù)凍，其余分別放在4℃與10℃進(jìn)行冷脅迫處理，經(jīng)過(guò)1、2、3、4h處理后，放入－80℃預(yù)凍后進(jìn)行冷凍干燥

1.2.2 凍干存活率計(jì)算 將凍干后的菌粉用PBS復(fù)水至凍干前相同體積，采用MRS倒平板法，37℃下培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)3個(gè)平行。根據(jù)NA/NB×100%計(jì)算存活率，NA是凍干后細(xì)胞數(shù)，NB為凍干前細(xì)胞數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞膜流動(dòng)性的測(cè)定 采用熒光雙折射法測(cè)定細(xì)胞膜流動(dòng)性。用四氫呋喃配制成2mmol/L DPH貯備液，使用前用PBS(pH 7.0)稀釋至2μmol/L備用。取2mL菌懸液(適宜菌濃度)離心后棄上清。加入2mL DPH試劑，混合均勻，在30℃條件下溫浴一段時(shí)間，然后，在8000r/min條件下離心去上清，加入2mL PBS混合均勻，進(jìn)行熒光測(cè)定。選擇合適的激發(fā)波長(zhǎng)，發(fā)射波長(zhǎng)，選擇適當(dāng)?shù)莫M縫(5mm)和靈敏度，非標(biāo)記細(xì)胞為空白對(duì)照。

熒光偏振(P)和細(xì)胞的平均微粘度(η)的計(jì)算公式如下:

IVV和IVH分別表示:激發(fā)光為垂直方向的偏振光，而發(fā)射光分別為垂直和水平方向的偏振光時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度;G為光柵矯正因子(G=IVH/IHH)，IHV和IHH是激發(fā)光為水平方向的偏振光，而發(fā)射光分別為垂直和水平方向的偏振光時(shí)測(cè)得的熒光強(qiáng)度。P和η越大說(shuō)明細(xì)胞膜流動(dòng)性越小。

1.2.4 熒光雙折射法測(cè)定羅伊氏乳酸桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性條件優(yōu)化 以360nm為激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)DPH溶液，未標(biāo)記染料的空白菌體溶液和用DPH標(biāo)記的菌體分別掃描，以確定發(fā)射波長(zhǎng)。通過(guò)不同菌濃度(OD值)標(biāo)記的樣品的比較確定合適的菌濃度。將同一組標(biāo)記的菌體用不同的溫浴時(shí)間處理，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定最佳溫浴時(shí)間。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 細(xì)胞膜流動(dòng)性的數(shù)據(jù)利用DPS7.05，采用Duncan新復(fù)極差法(SSR)多重比較，結(jié)果以±s表示，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 膜流動(dòng)性條件的優(yōu)化

2.1.1 DPH標(biāo)記菌體發(fā)射波長(zhǎng)的確定 選擇360nm為激發(fā)波長(zhǎng)，分別掃描了含有2μmol/L DPH溶液、未標(biāo)記菌體(OD為0.2)及標(biāo)記菌體的熒光發(fā)射光譜，結(jié)果見(jiàn)圖1～圖3。

從圖1，圖2可以看出沒(méi)有加菌體時(shí)的染料和未加染料的菌體最高峰都是414nm，圖3為加了染料標(biāo)記的菌體，其最高峰移至430nm，說(shuō)明430nm的波峰是由熒光激發(fā)的，而在PBS中2×10－6mol/L的DPH是沒(méi)有熒光的，只有菌體也不能激發(fā)430nm的熒光波峰。當(dāng)DPH摻入到細(xì)胞膜脂的烴鏈區(qū)后，介質(zhì)粘度變大，順?lè)串悩?gòu)化受到抑制，從而成為唯一能發(fā)熒光的全反構(gòu)型。結(jié)合后的DPH，其最大發(fā)射峰位在430nm。以360nm為激發(fā)波長(zhǎng)，確定發(fā)射波長(zhǎng)為430nm。

圖1 染料DPH熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectrum of DPH

圖2 未標(biāo)記菌體(OD 0.2)熒光光譜Fig.2 Fluorescence spectrum of unlabeled LAB

圖3 DPH標(biāo)記菌體(OD=0.2)熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectrum of labeled LAB

2.1.2 DPH標(biāo)記菌體菌濃度的確定 在激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)430nm條件下分別測(cè)定 OD600為0.1～0.9。

由圖4可以看出，菌濃度在OD小于0.6的情況下，熒光強(qiáng)度隨著菌濃度的上升而增強(qiáng)，當(dāng)OD大于0.8時(shí)，熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定，因此，確定最適當(dāng)?shù)木鷿舛葹镺D 0.8。

2.1.3 孵育時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響 在上述條件下，將菌體孵育10、20、30、40min，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可見(jiàn)，熒光強(qiáng)度在20min后即達(dá)平衡，30min后開(kāi)始下降，這可能是DPH自身淬滅的結(jié)果。故選擇樣品在30℃下溫育20min。

通過(guò)以上確立了羅伊氏乳酸桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性實(shí)驗(yàn)的條件:激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)430nm，菌濃度為OD 0.8，孵育時(shí)間為20min。在此條件下測(cè)定羅伊氏乳酸桿菌熒光光譜如圖6所示。

圖4 菌濃度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of OD on fluorescence intensity

圖5 孵育時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of time on fluorescence intensity

圖6 最佳條件下DPH標(biāo)記羅伊氏乳酸桿菌熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectrum of labeled LAB under the optimum conditions

通過(guò)圖6可以看出，在最佳條件下，菌體的熒光發(fā)射光譜發(fā)生了顯著的變化，在430nm處熒光強(qiáng)度高達(dá)18.96。

2.2 冷脅迫處理對(duì)菌體存活率的影響

菌體按照方法1.2.1處理后進(jìn)行冷凍干燥，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 冷脅迫對(duì)冷凍干燥乳酸菌存活率的影響Fig.7 Effect of stress on the survival rate of LAB during freeze－drying

通過(guò)圖7可以看出經(jīng)過(guò)不同的脅迫處理后，冷凍干燥羅伊氏乳酸桿菌的存活率有一定的差異，其中以4℃、3h最高為91.90%，其次為4℃、2h處理為89.16%，分別比未處理組85.77%提高了6.13%，3.39%。說(shuō)明經(jīng)過(guò)脅迫處理后可以改善菌體的抗冷凍干燥的能力。

2.3 冷脅迫對(duì)菌體活力及細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響

在最適實(shí)驗(yàn)條件，測(cè)定冷脅迫條件下冷凍干燥后菌種的活力(發(fā)酵MRS培養(yǎng)基6h)及細(xì)胞膜流動(dòng)性，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用 DPS7.05采用Duncan新復(fù)極差法(SSR)多重比較，結(jié)果以±s表示，P＜0.05為差異顯著，結(jié)果如圖8所示。

圖8 冷脅迫對(duì)乳酸菌活力及細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響Fig.8 Effect of cold stress on the membrane fluidity and cell viability of LAB during freeze－drying

從圖8可以看出，不同的脅迫溫度和處理時(shí)間對(duì)凍干后菌體活力，細(xì)胞膜的熒光偏振度(P)和細(xì)胞膜微粘度(η)的影響不同，但是變化的趨勢(shì)較為一致，其中經(jīng)過(guò)4℃、2h處理后，冷凍干燥菌體的熒光偏振度(P)和細(xì)胞膜微粘度(η)最小，分別為0.328 ±0.007，5.05±0.35，說(shuō)明此時(shí)的細(xì)胞膜流動(dòng)性最好。同時(shí)，菌體發(fā)酵的pH最低為5.35，說(shuō)明菌體的活力最好。與之相反的是經(jīng)過(guò)4℃、4h處理后，P和η分別達(dá)到最大，此時(shí)的菌體活力最小，以上結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞膜流動(dòng)性與菌體活力有一定的相關(guān)性。

3 結(jié)論

利用DPH為熒光探劑，測(cè)定羅伊氏乳酸桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性的方法是可行的，其最佳測(cè)定條件為:激發(fā)波長(zhǎng)360nm，發(fā)射波長(zhǎng)430nm，菌濃度為OD 0.8，30℃孵育時(shí)間為20min。羅伊氏乳酸桿菌經(jīng)過(guò)4℃、3h和4℃、2h冷凍脅迫處理后，提高了菌體冷凍干燥的存活率。通過(guò)分析冷凍干燥后菌體的細(xì)胞膜流動(dòng)性及細(xì)胞活力，細(xì)胞膜流動(dòng)性與細(xì)胞活力具有一定的相關(guān)性，其中菌體經(jīng)過(guò)4℃、2h冷凍脅迫后菌體的活力及流動(dòng)性都相對(duì)于對(duì)照組有所提高。

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Effect of cold stress on membrane fluidity of Lactobacillus reuteri during freeze－drying

LI Bao－kun1，2，TIAN Feng－wei1，LIU Xiao－ming1，ZHAO Jian－xin1，ZHANG Hao1，SONG Yuan－da1，CHEN Wei1，*
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China;2.School of Food，Shihezi University，Shihezi 832000，China)

The 1，6－diphenyl－1，3，5－h(huán)exatriene(DPH)was used as fluorescence probe to label the membrane of Lactobacillus reuteri.The optimum conditions were established to measure the membrane fluidity of L.reuteri by labeling with DPH:excitation wavelength 360nm，emission wavelength 430nm，adjust OD600of L.reuteri to 0.8，incubateed at 30℃ in the dark for 20 min.Meanwhile，the survival rates，viability and membrane fluidity of L.reuteri were measured after cold stress during freeze－drying.The results showed that the survival rates of freeze－drying Lactobacillus reuteri were improved by cold stress.At same time，the membrane fluidity was changed.The results implied that cold stress could improve cryotolerance of L.reuteri and prevent damage of freeze－drying.

cold stress;Lactobacillus reuteri;DPH;membrane fluidity;freeze－drying

TS201.2

A

1002－0306(2012)08－0137－04

細(xì)胞膜是細(xì)胞生命活動(dòng)的必需組織，細(xì)胞膜的正常生理功能有賴于膜結(jié)構(gòu)的完整和膜脂的恒定流動(dòng)，細(xì)胞膜的流動(dòng)性是其重要的動(dòng)力學(xué)特征，與生物體的生命活動(dòng)密切相關(guān)［1］。適宜的流動(dòng)性是保證細(xì)胞處于正常生理狀態(tài)的重要條件。流動(dòng)性的改變給細(xì)胞正常的生理活動(dòng)帶來(lái)不利的影響，使細(xì)胞膜生理功能發(fā)生障礙［2－4］。冷凍干燥是益生菌發(fā)酵劑最常用的一種保藏方式，在冷凍干燥的過(guò)程中會(huì)改變細(xì)胞流動(dòng)性，引起細(xì)胞活力的下降［5－6］。近年來(lái)，一些研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍干燥前進(jìn)行脅迫處理如冷脅迫，熱脅迫處理后可以提高菌種的冷凍干燥存活率［7］。1，6－二苯基－1，3，5－己三烯(DPH)是一種比較敏感的熒光探劑常用于研究膜脂流動(dòng)性［8］，本研究將利用DPH對(duì)羅伊氏乳酸桿菌進(jìn)行標(biāo)記，測(cè)定細(xì)胞膜流動(dòng)性，其研究目的主要有三個(gè)方面:a.優(yōu)化DPH熒光標(biāo)記羅伊氏乳酸桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性測(cè)定條件;b.評(píng)價(jià)冷脅迫對(duì)羅伊氏乳酸桿菌冷凍干燥存活率的影響;c.分析冷脅迫后冷凍干燥乳酸菌細(xì)胞膜流動(dòng)性及活力的相關(guān)性，從細(xì)胞水平上分析冷脅迫對(duì)冷凍干燥乳酸菌的作用機(jī)制。

2011－08－23 *通訊聯(lián)系人

李寶坤(1979－)，男，講師，在讀博士研究生，研究方向:食品微生物學(xué)。

國(guó)家自然基金(20836003，30871952);“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2009BADC1B02，2009BADB9B05);“十二五”國(guó)家“863”計(jì)劃(2011AA100901，2011AA100902)。