趙 靜，黃光榮，蔣家新

（中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018）

響應(yīng)面優(yōu)化蝦頭殼酶促水解清除DPPH自由基活性的研究

趙 靜，黃光榮*，蔣家新

（中國計量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018）

以堿性蛋白酶水解蝦頭殼蛋白質(zhì)，在影響水解條件單因素研究基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面方法中心組合設(shè)計，建立以DPPH自由基清除率為指標(biāo)的水解模型，優(yōu)化得出最佳酶解條件，并測定水解液中多肽的相對分子質(zhì)量分布。結(jié)果表明，最佳酶解條件為pH7.2、溫度50.5℃、加酶量415U/g、時間120min。在此條件下水解，水解度達(dá)21.8%，DPPH自由基清除率為66.9%，平均肽段長度為4.6，酶解液中大部分肽的相對分子量低于6500u。

蝦頭，堿性蛋白酶，響應(yīng)面分析，DPPH自由基清除率，水解度

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝦頭殼 購于浙江溫州水產(chǎn)品市場，樣品經(jīng)曬干后100℃烘干再機(jī)械粉碎后過100目篩，4℃密閉下保存?zhèn)溆?；堿性蛋白酶（2×105U/g） 上海楷洋生物技術(shù)有限公司；DPPH（二苯代苦味肼基自由基） 上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；分子量標(biāo)準(zhǔn)品維生素B12（Mr1335） 上海伯奧生物科技有限公司；抑肽酶（Mr6500）、細(xì)胞色素C（Mr14400，純度97%） 美國Sigma公司；牛血清白蛋白（Mr66700） 華美生物工程公司；其余化學(xué)試劑 均為分析純。

DT-04電動粉碎機(jī) 上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司；3200DE型數(shù)據(jù)超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；H-16-1高速臺式離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DEF-60-1真空干燥箱 杭州藍(lán)天化驗儀器廠；DELTA320 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV/V-1200型紫外/可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；SPD-20A高效液相色譜儀 島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 稱取5.0g蝦殼粉，放入150mL錐形瓶中，按料液比1∶10加入50mL去離子水，調(diào)到所需pH后，加入一定量的酶進(jìn)行水解，酶解過程中不斷攪拌并調(diào)pH，一定時間后在沸水浴中滅酶10min，冷卻后以4000r/min離心得上清液保存?zhèn)溆?，工藝流程簡要如圖1所示。

圖1 堿性蛋白酶水解蝦頭工藝流程Fig.1 Process of alkaline protease hydrolysis shrimp head

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 水解度 水解液氨基態(tài)氮和樣品中游離氨基態(tài)氮的含量以TNBS法測定[10]；樣品總氮含量消解后根據(jù)TNBS法測定。消解方法：取0.5g樣品到消解罐中，加入6mol/L鹽酸10mL，微波消解5min后取出，冷卻后用去離子水定容至100mL，待測。

水解度（DH，%）=（N1-N3）/N2×100%

式中：N1-水解液中水解液氨基態(tài)氮的含量，mmol/g；N2-蝦頭殼中樣品總氮含量，mmol/g；N3-蝦頭殼中游離氨基態(tài)氮含量，mmol/g。

1.2.2.2 蛋白質(zhì)含量 以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用福林酚法測定樣品中蛋白質(zhì)含量[11]。

1.2.2.3 總酚含量 按參考文獻(xiàn)[12]方法進(jìn)行。取稀釋后的樣品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或去離子水（作為空白對照）0.4mL分別加入到20mL試管中，然后加入1mL去離子水、1mL 0.1mol/L福林酚試劑，搖勻并在室溫下靜置5～8min。再加入2mL Na2CO3溶液（75g/L），搖勻后室溫下靜置2h，最后3000×g離心10min，測定765nm處的吸光度。以沒食子酸含量表示總酚含量。

1.2.2.4 DPPH自由基清除能力 按參考文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行。2mL 0.1mmol/L DPPH甲醇溶液與0.2mL試樣及1.3mL去離子水混合，于室溫下遮光放置30min，517nm下測定吸光度值（A）；以0.2mL去離子水代替樣品為空白對照（A’）；以0.2mL樣品與5mL甲醇混合液為樣品本底吸收校正（Aj）。DPPH自由基清除能力（DPPH Scavenging Activity，DSA）按下式計算：DSA（%）=[1-（A-Aj）/A’]×100%

1.2.2.5 肽相對分子質(zhì)量分布 以高效液相色譜法測定樣品中肽相對分子質(zhì)量分布。分子量標(biāo)準(zhǔn)品為維生素B12、抑肽酶、細(xì)胞色素C、牛血清白蛋白。色譜條件為：色譜柱（5Diol-120-Ⅱ，7.5mm×600mm），流動相為含有100mmol/L Na2SO4的pH7.0 20mmol/L磷酸緩沖溶液，流速為1.0mL/min，柱溫為室溫，紫外檢測波長220nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素條件對蝦頭殼蛋白質(zhì)酶促水解的影響

對可能影響酶解液中活性物質(zhì)提取效果的因素，如pH、溫度、加酶量、時間進(jìn)行單因素實驗，以確定相關(guān)因素及各因素的合適范圍。對10%蝦殼粉情況下，固定pH7.5、加酶量（E/S=2000U/g蛋白）、溫度（55℃）、水解時間（3h）四個因素中三個進(jìn)行了實驗，考察單一因素對水解度和清除DPPH自由基能力的影響，結(jié)果如圖2～圖5所示。

圖2 pH對水解度和DPPH自由基清除能力的影響Fig.2 Effect of pH on hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging activity

圖3 溫度對水解度和DPPH自由基清除能力的影響Fig.3 Effect of temperature on hydrolysis degree and DPPH

圖4 加酶量對水解度和DPPH自由基清除能力的影響Fig.4 Effect of enzyme content on hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging activity

圖5 水解時間對水解度和DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree and DPPH free radical scavenging activity

由圖2可以看出，DPPH自由基清除能力隨pH的增加而緩慢降低。有文獻(xiàn)[14]報道pH對DPPH分析體系的影響較大，強(qiáng)酸、強(qiáng)堿使DPPH溶液迅速失效，在pH2～10范圍內(nèi)物質(zhì)的抗氧化活性隨pH的升高而降低。從圖3可以看出，當(dāng)溫度為55℃時，水解度及DPPH自由基清除能力均達(dá)到最大，接近該酶的最適溫度。過高的溫度會使DPPH自由基清除能力下降，這可能是水解溫度過高導(dǎo)致蛋白酶活力下降，從而影響蝦蛋白的進(jìn)一步水解。從圖4可以看出，在加酶量為2400U/g之前，隨著加酶量的繼續(xù)增加，反應(yīng)體系中酶的濃度過高，酶與酶之間產(chǎn)生了競爭性抑制，導(dǎo)致了抗氧化物質(zhì)生成量的減少，之后再加入酶，又有多余的酶從競爭中脫離出來進(jìn)行酶解。整個過程中，水解度隨著加酶量的增大而增大。DPPH自由基清除率的最大值沒有很好的體現(xiàn)，可能是加酶量過大。從圖5可以看出，水解度隨著水解時間的延長而增大，DPPH自由基清除率總體呈上升趨勢，后期趨于平緩甚至下降。

綜合以上分析及文獻(xiàn)資料[15]，最后確定pH7.8、E/S= 400U/g、55℃、水解時間90min為中心值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化堿性蛋白酶水解條件。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化酶解條件

綜合單因素實驗結(jié)果，選擇pH、溫度、加酶量、時間為考察變量，中心點分別為pH7.8、55℃、E/S=400U/g、90min，變化步長分別為0.6、5、200和30，以Design-Expert 7.0軟件設(shè)計響應(yīng)面分析中心組合實驗，實驗次數(shù)為30，其中6個為中心點。實驗設(shè)計及結(jié)果見表1所示。

根據(jù)中心組合設(shè)計實驗結(jié)果，研究水解度、總酚含量與DPPH自由基清除率的關(guān)系如圖6所示。從圖6可以看出，水解度和總酚含量與DPPH自由基清除率的相關(guān)性較差，因此在酶促水解蝦頭殼蛋白質(zhì)獲得高DPPH自由基清除能力肽時不能依靠水解度或總酚含量作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。

經(jīng)Design-Expert7.0軟件對表1中實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合和回歸方差分析，得到的結(jié)果如表2所示?；貧w方程（模型）中各變量對指標(biāo)（響應(yīng)值）影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率P值（Prob＞F）越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。由表2可知，對響應(yīng)值DPPH自由基清除率作用顯著的是X1、X2、X1X4、X2X4、X12、X22、X32、X42。在各影響因素中對DPPH自由基清除率的影響大小依次為：pH＞溫度＞加酶量＞時間。從表中還可以看到平方項的影響較大，說明影響值與實驗因素之間并不是簡單的線性關(guān)系。對DPPH自由基清除率有較強(qiáng)交互作用的是pH和時間、溫度和時間。由表2可知，DPPH自由基清除率回歸方程的回歸效果極顯著。模型失擬項表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率。表2中模型失擬項的P值為0.2976，大于0.05，表明模型失擬項不顯著，模型建立的回歸方程能較好地解釋響應(yīng)結(jié)果并預(yù)測最佳酶解條件。

表1 中心組合設(shè)計及實驗結(jié)果Table 1 Central composite design and experimental results

圖6 水解度、總酚含量與DPPH·清除率之間的關(guān)系Fig.6 Relationship between hydrolysis degree，total phenolic content and DPPH free radical scavenge rate

表2 回歸方程方差分析表Table 2 Analysis results of regression and variance

選擇對響應(yīng)值影響顯著的各項得到以DPPH·清除率Y為目標(biāo)函數(shù)的回歸方程為：

其中，X1為pH，X2為溫度（℃），X3為E/S（U/g），X4為水解時間（h）。

根據(jù)Statistic6.0軟件繪制不同影響因素對于響應(yīng)值的三維曲線圖，如圖7所示。響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對各實驗因素所構(gòu)成的三維空間曲線圖，曲面越陡峭，則表明該因素對實驗結(jié)果的影響越大，相應(yīng)表現(xiàn)為響應(yīng)值變化的大小。等值線圖的性狀則可以反映出各因素效應(yīng)強(qiáng)弱的大小，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反[16]。從圖7可知，時間與pH、時間與溫度交互作用圖的等高線圖呈橢圓形，表示這兩因素之間的相互影響較大，結(jié)果與回歸方程的方差分析相吻合。

圖7 各因素間的交互作用圖Fig.7 Interaction between the factors注：A～F為分別固定其中兩個影響因素在中心點，各因素中心點分別為pH7.8、55℃、E/S=400U/g、90min。

根據(jù)中心組合設(shè)計實驗所得的結(jié)果和二次多項回歸方程，利用Design Expert獲得了DPPH自由基清除能力最高時的各個因素的最佳酶解條件為：pH7.2，溫度50.5℃，加酶量415U/g，時間120min。為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最佳條件下進(jìn)行酶解，制備3批樣品分別測定其水解度及DPPH自由基清除率。理論水解度為23.5%，平均肽段長度為4.3，DPPH·清除率為66.1%，實際測得的水解度為21.8%，DPPH·清除率為66.9%，平均肽段長度為4.6。該模型能較好地預(yù)測實際酶解情況。

2.3 相對分子質(zhì)量分布

圖8 蝦頭殼酶促水解液蛋白質(zhì)分子量分布圖Fig.8 Protein molecular weight distribution of shrimp head enzymatic hydrolysis

將最佳水解條件下水解得到的酶解液進(jìn)行液相色譜測定其分子量分布情況，結(jié)果如圖8所示。從圖8中可以看出酶解液中大部分肽的相對分子量低于6500。

3 結(jié)論

本文考察了堿性蛋白酶水解蝦頭殼蛋白質(zhì)獲得高DPPH自由基清除能力多肽的酶促水解條件。通過響應(yīng)面設(shè)計法的中心組合實驗優(yōu)化后得到最佳酶解條件為pH7.2，溫度50.5℃，加酶量415U/g，時間120min。在此最佳條件下水解，水解度21.8%，DPPH自由基清除率為66.9%，平均肽段長度為4.6，酶解液中大部分肽相對分子量低于6500。由二次旋轉(zhuǎn)模型預(yù)測的DPPH自由基清除率與實際測定值比較相符。

[1]章繼華，何永進(jìn).蝦頭的綜合開發(fā)與利用[J].農(nóng)牧產(chǎn)品開發(fā)，1997（4）：20-21.

[2]陳天忠，姚歆和，文利新.蝦頭、蝦殼資源綜合利用研究進(jìn)展[J].湖南飼料，2006（4）：35-36.

[3]慕運動.響應(yīng)面方法及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].鄭州工程學(xué)院學(xué)報，2001，22（3）：91-94.

[4]任嬌艷，趙謀明，崔春，等.草魚源抗氧化肽的響應(yīng)面法優(yōu)化制備及活性評價[J].食品工業(yè)科技，2009，30（7）：69-73.

[5]王小軍，張綿松，袁文鵬，等.鯤魚蛋白酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化[J].食品研究與開發(fā)，2009，30（12）：48-53.

[6]盤賽昆，顧小紅，湯堅，等.鳙魚肉酶解物清除羥自由基的研究[J].食品與機(jī)械，2009，25（4）：64-67.

[7]涂宗財，王艷敏，遲海霞，等.響應(yīng)面法優(yōu)化豆豉蛋白酶解工藝[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（6）：116-120.

[8]Balaraman K，Mathew N.Optimization of media composition for the production of cyclosporin A by Tolypocladium species[J]. Indian J Med Res，2006，123（4）：525-530.

[9]Wu QL，Chen T，Gan Y.Optimization of riboflavin pro-duction by recombinant Bacillus subtilis RH44 using statisticaldesigns[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2007，76（4）：783-794.

[10]Jens Alder-Nissen.Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates by trinitrobenzenesulfonic acid[J].J Agri Food Chem，1979，27（6）：1256-1262.

[11]薛莉珠.生物化學(xué)實驗[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1998.

[12]王恒山，潘英明，李海云，等.桂花種子皮黑色素的提取及其抗氧化活性研究[J].云南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，26（6）：55-57.

[13]姚增玉.山杏種皮黑色素提取及其性質(zhì)研究[D].咸陽：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

[14]許申鴻，杭瑚.溶劑及pH對1，1-二苯基-2-苦肼基自由基分析法的影響[J].分析測試學(xué)報，2000，19（3）：50-52.

[15]朱志偉，曾慶孝，林奕封，等.蝦頭的內(nèi)源蛋白酶酶解及復(fù)合酶解研究[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報，2003，22（2）：4-7.

[16]王允祥，呂鳳霞，陸兆新.杯傘發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2004，27（3）：89.

Study on response surface methodology to optimize the DPPH radical scavenging activity of shrimp enzymatic hydrolysate products

ZHAO Jing，HUANG Guang-rong*，JIANG Jia-xin
（College of Life Sciences，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China）

The purpose was using alkaline protease to optimize enzymatic hydrolysis parameters to produce peptides with high DPPH（2，2-diphenyl-1-picryl hydrazyl）radical scavenging activity（DSA）from shrimp processing by-products.A central composite design（CCD）part of response surface analysis（RSM）was used as an experimental design based on the single-factor to achieve the highest scavenging activity.The results showed that the optimal enzymatic hydrolysis conditions were temperature 50.5℃，time duration 120min，pH7.2，enzyme concentration 415U/g.The degree of hydrolysis（DH），DSA，the average length of peptides and average relative molecular weight under this condition was 21.8%，66.9%，4.6 and 6500u，respectively.

shrimp by-products；alkaline protease；response surface methodology；DPPH·scavenging activity；hydrolysis degree

TS254.1

A

1002-0306（2012）03-0174-05

我國蝦類資源極為豐富，隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和海洋捕撈業(yè)的迅速發(fā)展，蝦產(chǎn)量不斷增加，僅對蝦年產(chǎn)量就達(dá)40萬t。為了便于保鮮，大部分蝦均以無頭無殼的冷凍蝦仁形式提供于國際市場，而蝦頭殼占蝦體重量50%左右，是蝦加工過程中的副產(chǎn)品。蝦頭殼中含有約30%～40%（以干物質(zhì)計）的蛋白質(zhì)，目前我國蝦頭殼大部分被用于生產(chǎn)飼料，附加值較低。蝦頭殼由蝦殼和可食部分組成，前者的主要成分為甲殼質(zhì)，后者主要由蝦腦、肝、蝦肉等構(gòu)成。蝦頭殼中的蛋白質(zhì)是一種優(yōu)質(zhì)完全蛋白質(zhì)資源，世界許多國家都著力開發(fā)這一動物蛋白質(zhì)資源。目前，蝦頭綜合開發(fā)利用的制品主要有甲殼質(zhì)、殼聚糖、蝦腦糖、蝦腦油、蝦黃醬、蝦精粉、蝦香味素等[1]。一些動、植物蛋白在適宜的作用條件下可產(chǎn)生具有抗氧化性的活性肽。植物蛋白主要是以大豆、花生蛋白研究較多；動物蛋白則對魚類蛋白進(jìn)行的研究較多。酶法生產(chǎn)活性肽具有安全性高、生產(chǎn)條件溫和、水解易控制、可定位生產(chǎn)特定的肽、成本低等優(yōu)點而成為現(xiàn)在普遍的生產(chǎn)方法[2]。由于蛋白酶解體系相對復(fù)雜，影響因素有很多，通過響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）尋求最優(yōu)工藝的方法比以往的正交設(shè)計或均勻設(shè)計精度高，預(yù)測性更好[3]，目前已應(yīng)用于水解各種魚類[4-6]、大豆[7]等蛋白質(zhì)產(chǎn)生生物活性肽的研究。本研究以堿性蛋白酶水解蝦頭殼，采用響應(yīng)面分析的中心組合設(shè)計（central composite design，CCD）方法優(yōu)化水解條件，將蛋白質(zhì)分解成具有較高DPPH自由基清除能力的低分子量生物活性肽類物質(zhì)，期望為蝦頭殼優(yōu)質(zhì)蛋白資源的開發(fā)利用提供理論和實踐依據(jù)。

2011-04-07 *通訊聯(lián)系人

趙靜（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品資源利用與生化分離。