李 楊，周 堅(jiān)，萬 盈，李吉緒

（武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

蓮子皮生物堿超聲波輔助提取條件優(yōu)化及抗氧化性研究

李 楊，周 堅(jiān)*，萬 盈，李吉緒

（武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023）

為了確定蓮子皮中生物堿類物質(zhì)的提取工藝和初步鑒定該類物質(zhì)的活性，以生物堿得率為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)，研究了提取時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、液料比四個(gè)因素對(duì)生物堿類化合物提取的影響。同時(shí)，以生物堿類物質(zhì)對(duì)DPPH自由基、超氧離子自由基、羥基自由基的清除率作為考察指標(biāo)，研究了蓮子皮生物堿的體外抗氧化活性。確定了最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間為45min，超聲功率為70W，乙醇濃度為80%，液料比25∶1。生物堿具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，對(duì)DPPH·、O2-·、·OH均具有良好的清除作用。

蓮子皮，生物堿，超聲波提取，抗氧化活性

蓮子皮（lotusseed skins）屬睡蓮科蓮屬（Nympheaceae Nelumbo Adans）蓮的種皮，其味澀，性涼，歸心、脾經(jīng)，具有清熱利濕、收斂之功效，配車前子、木通用治濕熱泄痢[1]。蓮子是福建、浙江、湖南、湖北、江蘇、河北等地廣為流傳的一種既可當(dāng)做食物也可作為中藥的物質(zhì)，含有豐富的多糖、磷脂、生物堿和類黃酮等營(yíng)養(yǎng)保健成分[2]。據(jù)研究，蓮子心里面含有蓮心堿（Liensi-nine）、異蓮心（Isoliensinine）、甲基蓮心（Neferine）、荷葉堿（Nu-ciferine）、前荷葉堿（Pronucifefine）、甲基紫堇杷靈（Methylcorv-palline）、去甲基烏藥堿（Demethylcoclaurine）、牛角花素（Lotusine）等生物堿，它們的藥用功能已有制劑用于臨床[3]。近年來，國內(nèi)對(duì)蓮子和蓮子心在多糖、生物堿、黃酮等方面的研究取得了較大的成就[4-9]，但對(duì)蓮子皮功效成分的研究幾乎沒有，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取法對(duì)蓮子皮的生物堿提取工藝及體外抗氧化活性進(jìn)行研究，為蓮子皮活性成分的進(jìn)一步研究開發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓮子皮粉末 湖北魚米鄉(xiāng)食品有限公司，過60目篩，水分10.56%、蛋白質(zhì)21.5%、灰分5.5%；蓮心堿 深圳市美荷生物科技有限公司，色譜純；二苯代苦味酰自由基（DPPH·） sigma公司，色譜純；水楊酸、鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、抗壞血酸 國藥集團(tuán)，分析純。

KQ2200DV型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；pH酸度計(jì) 梅特勒-托利多公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總生物堿的提取方法[10]稱取一定質(zhì)量的干蓮子皮粉2g，置于具塞三角錐形瓶中，加入80%的無水乙醇40mL超聲提取。過濾，濾液置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，在殘?jiān)屑尤雙H=1的鹽酸溶液20mL溶解，離心棄去不溶物，濾液加入氨水調(diào)節(jié)pH至9，用等量的乙醚萃取3次，合并乙醚液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收乙醚，殘?jiān)脽o水乙醇溶解，定容至50mL，即得。

1.2.2 總生物堿得率的測(cè)定

1.2.2.1 總生物堿的紫外吸收光譜的測(cè)定 取蓮心堿對(duì)照品溶液，于200～400nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，測(cè)得其在283nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，故選擇283nm為最大吸收波長(zhǎng)。在200～400nm處對(duì)樣品溶液、對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，紫外吸收光譜如圖1、圖2。

圖1 蓮心堿標(biāo)樣紫外吸收?qǐng)D譜Fig.1 Ultraviolet absorption spectra of liensi-nine

圖2 樣品溶液紫外吸收?qǐng)D譜Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of sample

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[12]精密稱取9.17mg蓮心堿標(biāo)準(zhǔn)品，用乙醇溶解定容至10mL，配成濃度為0.917mg/mL的溶液。取0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別置于10mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，溶液濃度分別為27.51、36.68、45.85、55.02、64.19、73.36、82.53μg/mL。以無水乙醇為空白，于283nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度（C，μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=0.0151C-0.0036，R2=0.9995（n=7）。

1.2.2.3 總生物堿得率的測(cè)定 取不同條件下所得蓮子皮總生物堿提取液，按1.2.1方法處理后，在283nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)上面得到的回歸方程計(jì)算總生物堿的含量。

式中：M1：總生物堿的含量，單位為μg/mL；M：蓮子皮粉的質(zhì)量，單位為g。

1.2.3 超聲波提取總生物堿單因素實(shí)驗(yàn) 先以提取時(shí)間、超聲功率、乙醇濃度、液料比四個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以確定各因子的影響效果和適宜的范圍。單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表見表1，然后根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取適當(dāng)條件范圍進(jìn)行四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)。

表1 蓮子皮生物堿提取單因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)Table 1 Single factor experiments for extracting alkaloid from lotus seed skins

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參考，選用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表，以提取時(shí)間（A）、超聲功率（B）、乙醇濃度（C）、液料比（D）為影響因素，以總生物堿得率為指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，從中篩選最優(yōu)的工藝條件。

表2 L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

1.2.5 生物堿的體外抗氧化活性

1.2.5.1 總生物堿清除DPPH·的能力[13-14]用無水乙醇配制40.35μg/mL的生物堿溶液，分別吸取1、1.5、2、2.5、3mL于10支具塞試管中（分2組），向其中一組加入DPPH溶液5mL，搖勻30min后在517nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，即為Ai，用無水乙醇作為參比；同時(shí)測(cè)定2.5mL DPPH溶液與2.5mL無水乙醇混合后的吸光度，即為Ac；向另一組加入無水乙醇至5mL，混合后測(cè)其吸光度，即為Aj。根據(jù)下式計(jì)算清除率：

同時(shí)用75%的乙醇配制濃度為40.35μg/mL的抗壞血酸溶液，按照上述步驟計(jì)算對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.2.5.2 總生物堿對(duì)O2-·的清除效果[15]取50mmol/L的Tris-HCl緩沖溶液（pH8.2）4.7mL，加入5mL的蒸餾水，混勻后在25℃的水浴中保溫20min，取出后立即加入于25℃預(yù)熱的0.3mL的鄰苯三酚溶液（用10mmol/L的HCl配制），迅速搖勻后，于325nm波長(zhǎng)下每隔30s測(cè)定吸光度，鄰苯三酚自動(dòng)氧化5min后，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值△A0，用10mmol/L的HCl代替鄰苯三酚做為空白。在加入鄰苯三酚之前加入不同體積的40.35μg/mL的生物堿溶液，作為待測(cè)液，按照上述步驟測(cè)定每分鐘吸光度的增加值△A。根據(jù)下式計(jì)算各待測(cè)物對(duì)O2-·的清除率。

1.2.5.3 總生物堿對(duì)·OH的清除效果[16-17]依次加入10mmol/L的水楊酸-無水乙醇溶液0.5mL，隨后加入1、1.5、2、2.5、3mL不同體積的40.35μg/mL的生物堿溶液，再加入0.5mL 10mmol/L的FeSO4以及不同體積的蒸餾水，使總體積到5mL，混勻后加入5mL 88mol/L的H2O2，啟動(dòng)Fenton反應(yīng)，搖勻后于510nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度即為A1；取0.5mL的蒸餾水代替濃度為10mmol/L的FeSO4，所測(cè)得的吸光度為A2；取0.5mL的蒸餾水代替生物堿溶液，所測(cè)得的吸光度為A3；根據(jù)下式計(jì)算各待測(cè)物對(duì)·OH的清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)生物堿得率的影響 本實(shí)驗(yàn)比較了不同超聲時(shí)間對(duì)蓮子皮中生物堿的提取效果，結(jié)果見圖3：當(dāng)提取時(shí)間在15min至45min之間時(shí)，生物堿得率提高；在45min達(dá)到最大值。隨后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，得率下降；60min延長(zhǎng)至75min時(shí)，生物堿的得率達(dá)到穩(wěn)定?？紤]實(shí)際生產(chǎn)和成本等因素，選擇15、30、45min作為正交提取實(shí)驗(yàn)的提取時(shí)間。

圖3 提取時(shí)間對(duì)生物堿得率的影響Fig.3 Influences of extraction time on yield of alkaloid

2.1.2 超聲功率對(duì)生物堿得率的影響 從圖4可以看出，生物堿得率開始隨著超聲功率的增大而增大，80W時(shí)達(dá)到最大值，隨后超聲功率繼續(xù)增大但提取率反而降低。一般來說，增大超聲波功率有助于目標(biāo)產(chǎn)物的提取，功率越大提取應(yīng)越完全，但超聲功率過大，很有可能破壞生物堿的結(jié)構(gòu)，使其分解，這是由于超聲功率過大時(shí)會(huì)產(chǎn)生并聚集大量的熱量，導(dǎo)致生物堿受熱分解，結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而降低生物堿的提取效果。

圖4 超聲功率對(duì)生物堿得率的影響Fig.4 Influences of supersonic power on yield of alkaloid

2.1.3 乙醇濃度對(duì)生物堿得率的影響 選取不同濃度乙醇提取生物堿，結(jié)果如圖5所示，當(dāng)溶劑濃度在50%～80%時(shí)，生物堿的得率會(huì)隨著濃度的增加逐步提高，在80%達(dá)到最大，溶劑濃度增大至90%時(shí)，得率稍稍下降，因此為了節(jié)約成本選定80%左右的乙醇最合適。

圖5 乙醇濃度對(duì)生物堿得率的影響Fig.5 Influences of ethanol concentration on yield of alkaloid

2.1.4 液料比對(duì)生物堿得率的影響 隨著溶劑用量的增加，生物堿得率增大，但當(dāng)液料比達(dá)到25∶1時(shí)，生物堿提取率最大，之后隨著溶劑繼續(xù)增加，生物堿得率的變化已不太明顯，這是由于在水溶液用量達(dá)到一定程度時(shí)蓮子皮中的生物堿已基本全部溶出，再增加溶劑用量，不但得率變化不大，還會(huì)給后續(xù)工藝增加困難。因此液料比選擇25∶1左右較為合適。

圖6 液料比對(duì)生物堿得率的影響Fig.6 Influences of liquid/material ratio on yield of alkaloid

2.2 生物堿提取工藝正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of the orthogonal experiment

根據(jù)以上單因素的結(jié)果，蓮子皮生物堿提取過程中采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

由極差分析和方差分析結(jié)果可知，液料比和提取時(shí)間對(duì)生物堿得率有顯著影響，乙醇濃度和提取功率對(duì)生物堿得率無顯著影響，即液料比gt;提取時(shí)間gt;溶劑濃度gt;超聲功率。正交實(shí)驗(yàn)得到理論上的最佳提取工藝條件為：A3B2C3D3，用此工藝提取生物堿，其得率為1.68mg/g，驗(yàn)證了最佳提取工藝是比較理想的。

表4 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表Table 4 Variance analysis of the L9（34）orthogonal experiments

2.3 生物堿體外抗氧化作用因素

2.3.1 生物堿對(duì)DPPH自由基的清除效果 結(jié)果由圖7可知，生物堿和抗壞血酸濃度在4.035～10.09μg/mL范圍時(shí)，隨著濃度的增大，二者對(duì)DPPH·的清除率明顯增大，增幅分別為86.20%和82.90%。當(dāng)濃度進(jìn)一步增大時(shí)，二者對(duì)DPPH·的清除率雖繼續(xù)增大，但增幅不明顯。當(dāng)濃度達(dá)到12.11μg/mL后，生物堿的清除效果略高于抗壞血酸。由此可見，二者對(duì)DPPH·的清除效果與濃度之間存在量效關(guān)系，并且達(dá)到一定濃度后，生物堿的清除效果高于抗壞血酸，生物堿具有較好的清除DPPH·的能力。

圖7 生物堿及抗壞血酸對(duì)DPPH·的清除效果Fig.7 Effect of alkaloid and ascorbic acid on DPPH·scavenging

2.3.2 生物堿對(duì)·OH和O2-·的清除效果 由表5可知，蓮子皮生物堿具有十分強(qiáng)的清除O2-·能力，當(dāng)生物堿的濃度在6.053μg/mL時(shí)，對(duì)O2-·的清除率就達(dá)到了92.03%，隨著生物堿濃度的增加，清除效果越好。通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS統(tǒng)計(jì)分析，可以得到生物堿濃度（x，μg/mL）與清除率（y，%）的回歸方程為y=0.0092x+ 0.8669，其相關(guān)系數(shù)為r=0.9798。

同時(shí)，生物堿對(duì)·OH也有一定的清除能力，清除效果也很好，生物堿的濃度在6.053μg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)到30.97%，而且清除效果隨著生物堿濃度的增加而增加，通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行SPSS統(tǒng)計(jì)分析，可以得到生物堿濃度（x，μg/mL）與清除率（y，%）的回歸方程為：y=0.0168x+0.2318，R2=0.9736。

表5 生物堿對(duì)O2-·和·OH的清除能力Table 5 Capacity of alkaloid for clearing O2-·and·OH

2.3.3 生物堿對(duì)不同自由基的清除效果實(shí)驗(yàn) 由圖8可知，生物堿在同濃度（6.053μg/mL）條件下，對(duì)DPPH·、O2-·及·OH的清除效果是不同的，其清除率分別為72.00%、92.03%、30.97%，即清除效果依次為：O2-·＞DPPH·＞·OH。

圖8 生物堿對(duì)3種自由基的清除效果Fig.8 Effect of alkaloid on three radicals

3 結(jié)論

通過正交實(shí)驗(yàn)，確定了蓮子皮中生物堿類化合物的最佳提取條件：液料比25∶1，提取時(shí)間為45min，乙醇濃度為80%，超聲功率為70W。在此工藝條件下，總生物堿得率為1.68mg/g。正交實(shí)驗(yàn)極差分析表明，四因素對(duì)生物堿提取的影響程度不同，其中液料比的影響最為顯著，其次是提取時(shí)間，再次是乙醇濃度，而超聲功率對(duì)提取的影響不大。同時(shí)，蓮子皮生物堿對(duì)O2-·具有很強(qiáng)的清除能力，對(duì)DPPH·、·OH也都具有很好的清除能力。

因此，蓮子皮生物堿是一種很好的天然抗氧化劑，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研制開發(fā)蓮子皮抗氧化和降血壓等功能性食品提供了一定的基礎(chǔ)。

[1]《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1976：3498.

[2]許益民.蓮子中磷脂成分的研究[J].植物學(xué)通報(bào)，1992（9）：46-47.

[3]潘競(jìng)先，陸軍，張建軍，等.蓮子心鈣拮抗活性成分的研究[J].北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，21（5）：401-403.

[4]王輝，周立，劉剛.蓮心堿對(duì)氧自由基引發(fā)紅細(xì)胞膜損傷的保護(hù)作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2006，22（9）：1088-1091.

[5]王輝，鄒英，何文，等.蓮心堿對(duì)大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護(hù)作用[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2003，22（8）：522-523.

[6]YoshikiK，AkihiroA，Yasumasa I，et al.Bioorganieamp;Medicinal Chemistry[J].2005（13）：443.

[7]王兵.甲基蓮心堿心血管藥理作用的研究進(jìn)展[J].中草藥，2000，31（2）：148-150.

[8]馮秀玲，喻欣，肖軍花.異蓮心堿對(duì)心血管功能及壓力超負(fù)荷型左心室肥大的作用[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2002，31（6）：608-611.

[9]Pam PC，Chou YL，Young PT，et al.Studies on the alkoids of embryo nucifera Gaertn，I.Isolation and characteristation of Liensinine[J].Scientia sinica，1962，11（2）：217.

[10]袁小紅.蓮子心4種提取方法的比較研究[J].中國藥房，2006，17（8）：637-638.

[11]郭毛娣，陳蘭貴.中國大陸產(chǎn)蓮子心中生物堿成分的研究[J].衛(wèi)生研究，1983（4）：12-16.

[12]袁小紅，趙瑞芝，丘小惠.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選蓮子心的半仿生提取工藝[J].中國藥房，2005，16（21）：1618.

[13]彭長(zhǎng)連，陳少薇，林植芳，等.用清除有機(jī)自由基DPPH法評(píng)價(jià)植物抗氧化能力[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2000，27（6）：658-661.

[14]Brand-Williams W，Cuvelier M E，Berset C.Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity[J].Lebensm Wissu-Technol，2004，28：25-30.

[15]吳海濤，張彧，繆琪，等.牡蠣水提液的抗氧化特性[J].食品發(fā)酵工業(yè)，2005，31（4）：42-45.

[16]Smirnoff N，Cumbes O J.Hydroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J].Phytochemistry，1989，28（4）：1057-1060.

[17]鄧乾春，陳春艷，潘雪梅，等.白果活性蛋白的酶法水解及抗氧化活性研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2005，21（11）：155-159.

Study on ultrasonic assisted extraction technology and antioxidative activity of alkaloid of lotus seed skins

LI Yang，ZHOU Jian*，WAN Ying，LI Ji-xu
（Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

In order to determine extraction process of alkaloid from lotus seed skins and authenticate the activity of the alkaloid，and by using orthogonal experiment，the influences of various parameters such as extraction time，supersonic power，ethanol concentration or liquid/material ratio on extraction efficiency were studied taking yield of alkaloid as study index.At the same time，taking clearance ability for DPPH·，O2-·and·OH as study index，its antioxidation in vitro was studied.The optimized parameters were as follows：extraction time：45min，supersonic power：70W，ethanol concentration：80%and liquid/material ratio：25∶1.The alkaloid of lotus seed skins had better antioxidation in vitro，and it had strong capacity of scavenging DPPH·，O2-·and·OH.

lotus seed skins；alkaloid；ultrasonic extraction；antioxidative activity

TS255.1

B

1002-0306（2012）03-0255-05

2011－03－03 *通訊聯(lián)系人

李楊（1986-），女，在讀研究生，主要從事糧食油脂及植物蛋白工程方面的研究。