錢(qián)時(shí)權(quán)，石亞中，伍亞華，李善菊，孫蘭萍，許 暉

（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030）

纖維素酶-超聲波輔助有機(jī)溶劑提取山葡萄渣中白藜蘆醇的研究

錢(qián)時(shí)權(quán)，石亞中，伍亞華，李善菊，孫蘭萍，許 暉

（蚌埠學(xué)院生物與食品工程系，安徽蚌埠233030）

為進(jìn)一步提高山葡萄渣中白藜蘆醇提取效率，研究了纖維素酶-超聲波強(qiáng)化處理對(duì)山葡萄渣中白藜蘆醇提取效果的影響。研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，分析纖維素酶酶解溫度、超聲波處理時(shí)間、料液比、提取時(shí)間對(duì)白藜蘆醇含量的影響。結(jié)果表明：山葡萄渣中白藜蘆醇提取的最佳提取工藝條件為：酶解溫度55℃，超聲處理時(shí)間5min，料液比1∶30，提取時(shí)間4h。在此條件下測(cè)得白藜蘆醇的含量為1.187mg·g-1。纖維素酶和超聲波復(fù)合處理提取工藝能更有效地提高山葡萄渣中白藜蘆醇含量，此工藝優(yōu)于纖維素酶、超聲波單一因素處理提取工藝。

白藜蘆醇，纖維素酶酶解，超聲波處理，有機(jī)溶劑

白藜蘆醇（Resveratro1，簡(jiǎn)稱(chēng)Res）是含有芪類(lèi)結(jié)構(gòu)的非黃酮類(lèi)多酚化合物[1]，易溶于氯仿、甲醇、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑[2]。白藜蘆醇是1940年日本人首次從毛葉藜蘆（Veratrum grandiflorum，O.Loes）的根中獲得的。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗癌、心血管保護(hù)、抗氧化等多方面的藥理作用[2-4]。白藜蘆醇提取的方法主要有有機(jī)溶劑法、熱水浸提法、超聲波法、超臨界萃取法、酶法等。纖維素酶能夠水解纖維，使植物細(xì)胞壁破壞，充分釋放細(xì)胞內(nèi)含物，有利于對(duì)有效成分的提取。而超聲波破碎能使生物活性物質(zhì)充分溶出，應(yīng)用超聲技術(shù)來(lái)強(qiáng)化提取工藝，可有效提高提取效率[5-6]。葡萄中含有豐富的白藜蘆醇，尤以葡萄皮和葡萄籽中為最多。本論文在前期研究[7]的基礎(chǔ)上研究不同提取條件對(duì)山葡萄渣中的白藜蘆醇提取效果的影響，然后在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件，以期獲得山葡萄渣白藜蘆醇提取的最佳工藝參數(shù)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)葡萄資源提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山葡萄渣粉末 將山葡萄皮、籽陰干，按1∶1（m/m）混合后粉碎過(guò)60目篩備用，購(gòu)自蚌埠市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度98% 購(gòu)自山東泓捷生物科技有限公司；纖維素酶，單位酶活力為500000U/g 河南省所以化工有限公司；無(wú)水乙醇、甲醇、丙酮 均為分析純。

紫外分光光度計(jì)752型 上海光學(xué)儀器廠；超聲波萃取儀 上海生析超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海予華儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白藜蘆醇的提取[8]用清水洗凈山葡萄渣，曬干后粉碎，過(guò)60目篩備用。取粉末1g，放入150mL錐形瓶中，加入適量水和纖維素酶進(jìn)行酶解，酶解后加入一定量體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇和丙酮，在功率為400W的條件下超聲波提取一段時(shí)間后，將提取液離心，經(jīng)濃縮、蒸發(fā)得白藜蘆醇樣品。

1.2.2 白藜蘆醇含量的測(cè)定[9]

1.2.2.1 白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 稱(chēng)取適量白藜蘆醇置于容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得白藜蘆醇對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備液，配制成一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于306nm處測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以對(duì)照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸線(xiàn)性方程y=0.6942x-0.0315（R2=0.9942），線(xiàn)性范圍為3.92～17.64μg/mL。從線(xiàn)性回歸方程看出，白藜蘆醇含量與吸光度值成正相關(guān)。

1.2.2.2 樣品中白藜蘆醇含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量樣品于250mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為樣品液，于306nm處測(cè)定吸光度值，由回歸線(xiàn)性方程得出白藜蘆醇含量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 酶解溫度對(duì)白藜蘆醇含量的影響 取適量粉末，纖維素酶添加量為1.5mg·g-1，纖維素酶添加量具體確定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8]，pH=5條件下，設(shè)置45～65℃，酶解1.5h。酶解后加入料液比為1∶35的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇和丙酮，先在功率為400W的條件下超聲波處理6min，然后再在75℃條件下提取4.5h后，將提取液離心，經(jīng)濃縮、蒸發(fā)得白藜蘆醇樣品。用甲醇溶解樣品并稀釋?zhuān)瑩u勻，于306nm處測(cè)定吸光度值，由回歸線(xiàn)性方程得出白藜蘆醇含量。

1.2.3.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)白藜蘆醇含量的影響 在功率為400W的條件下超聲波處理3～7min，其他條件同1.2.3.1。分析超聲波處理時(shí)間對(duì)白藜蘆醇含量的影響。

1.2.3.3 料液比對(duì)白藜蘆醇含量的影響 加入料液比為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇和丙酮，其他條件同1.2.3.1?？疾炝弦罕葘?duì)白藜蘆醇含量的影響。

1.2.3.4 提取時(shí)間對(duì)白藜蘆醇含量的影響 加入料液比為1∶35的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇和丙酮，提取2.5～4.5h。其他條件同1.2.3.1。探討提取時(shí)間對(duì)白藜蘆醇含量的影響。

1.2.3.5 提取溫度對(duì)白藜蘆醇含量的影響 加入料液比為1∶35的體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇和丙酮，在65～85℃提取4.5h。其他條件同1.2.3.1。考察提取溫度對(duì)白藜蘆醇含量的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)影響白藜蘆醇含量的主要因素，即酶解溫度、超聲波處理時(shí)間、料液比和提取時(shí)間，進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)表1。根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出山葡萄渣中白藜蘆醇提取的最佳條件。

表1 白藜蘆醇提取工藝因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)白藜蘆醇含量的影響

2.1.1 酶解溫度對(duì)白藜蘆醇提取效果的影響 結(jié)果如圖1所示，從圖1可以看出，酶解溫度在55℃時(shí)白藜蘆醇的含量最高，但在55℃以后，溫度升高，含量增加不明顯。在酶解反應(yīng)中，溫度與酶穩(wěn)定性和反應(yīng)速度有關(guān)。當(dāng)溫度升高時(shí)，反應(yīng)速度加快，有利于酶解的進(jìn)行，但溫度過(guò)高會(huì)使酶產(chǎn)生變性失活作用，影響酶與底物的結(jié)合，使反應(yīng)速度降低。因此選擇酶解溫度為55℃。

圖1 酶解溫度對(duì)白藜蘆醇提取效果的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on resveratrol extraction

圖2 超聲波處理時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取效果的影響Fig.2 Effect of ultrasonication time on resveratrol extraction

2.1.2 超聲波處理時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取效果的影響 結(jié)果如圖2所示，由圖2可知，超聲波處理時(shí)間為4～5min時(shí)，白藜蘆醇含量提高得最快，當(dāng)超聲波作用時(shí)間為5min時(shí)，白藜蘆醇含量達(dá)到最大，超聲波作用5min后，白藜蘆醇含量開(kāi)始慢慢降低，這可能是由于隨著超聲波處理時(shí)間的延長(zhǎng)，白藜蘆醇的穩(wěn)定性會(huì)有所下降，導(dǎo)致白藜蘆醇含量降低。2.1.3 料液比對(duì)白藜蘆醇提取效果的影響 分別選用不同的料液比對(duì)葡萄渣中白黎蘆醇進(jìn)行提取，料液比對(duì)白黎蘆醇含量的影響如圖3所示。由圖3可以看出，當(dāng)料液比1∶20～1∶30時(shí)，白黎蘆醇含量增加迅速，料液比為1∶30時(shí)，白黎蘆醇含量達(dá)到最大，料液比超過(guò)1∶30后白藜蘆醇含量增加很緩慢。結(jié)合實(shí)際綜合考慮，選擇料液比為1∶30較好。

圖3 料液比對(duì)白藜蘆醇提取效果的影響Fig.3 Effect of rate of solution to solid on resveratrol extraction

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取效果的影響 結(jié)果如圖4所示，由圖4不難看出，白藜蘆醇含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，提取時(shí)間為4h時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增加，白藜蘆醇含量反而有所下降，這可能與白藜蘆醇的熱敏性較強(qiáng)有關(guān)，在較高溫度下提取過(guò)長(zhǎng)時(shí)間使得白藜蘆醇發(fā)生分解，從而導(dǎo)致白藜蘆醇含量下降。

圖4 提取時(shí)間對(duì)白藜蘆醇提取效果的影響Fig.4 Effect of extraction time on resveratrol extraction

2.1.5 提取溫度對(duì)白藜蘆醇提取效果的影響 結(jié)果如圖5所示，隨著溫度的升高，白藜蘆醇含量先升后降，在60～75℃時(shí)白藜蘆醇含量逐漸增加，75℃時(shí)達(dá)到最大，隨后開(kāi)始下降，白藜蘆醇含量下降的原因是由于溫度的增加破壞了白藜蘆醇分子結(jié)構(gòu)，使其構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致其提取效率下降。因此，選擇75℃為白藜蘆醇提取溫度為宜。

圖5 提取溫度對(duì)白藜蘆醇提取效果的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on resveratrol extraction

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，考慮各因素之間相互影響，選取酶解溫度（A）、超聲處理時(shí)間（B）、料液比（C）、提取時(shí)間（D）4因素進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)。山葡萄渣白藜蘆醇提取條件的實(shí)驗(yàn)方案和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和表3所示。通過(guò)直觀分析可知，影響因素的大小順序?yàn)镃＞D＞B＞A，即料液比＞提取時(shí)間＞超聲處理時(shí)間＞酶解溫度。方差分析表明料液比對(duì)山葡萄渣中白藜蘆醇含量影響極顯著，提取時(shí)間對(duì)山葡萄渣中白藜蘆醇含量影響顯著，其它兩因素對(duì)白藜蘆醇含量影響不顯著。綜合以上因素和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定最佳提取工藝為A2B1C2D2，即酶解溫度55℃，超聲處理時(shí)間5min，料液比1∶30，提取時(shí)間4h。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments

表3 方差分析表Table 3 Analysis results of variance

2.3 提取效果比較驗(yàn)證

在不同提取方法和工藝條件下提取山葡萄渣中白藜蘆醇，結(jié)果見(jiàn)表4：方法4，即通過(guò)本論文正交實(shí)驗(yàn)獲得的最佳提取工藝，提取得到白藜蘆醇含量最高，達(dá)到1.187mg·g-1，其次是方法3，再次是方法2，而方法1的提取效果最不理想，白藜蘆醇含量?jī)H為0.660mg·g-1。由此不難看出，與方法1、方法2和方法3相比，方法4更能有效地提取山葡萄渣中的白藜蘆醇。

3 結(jié)論

3.1 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，得到山葡萄渣白藜蘆醇提取的最佳提取工藝條件為：酶解溫度55℃，超聲處理時(shí)間5min，料液比1∶30，提取時(shí)間4h。在此條件下，白藜蘆醇的含量為1.187mg·g-1。

3.2 通過(guò)比較驗(yàn)證，結(jié)果表明：經(jīng)纖維素酶和超聲波復(fù)合處理的提取工藝能更有效地提取山葡萄渣中白藜蘆醇，該工藝優(yōu)于纖維素酶、超聲波單一因素處理提取工藝。

表4 不同提取條件對(duì)Res含量的比較Table 4 Comparison of different extraction conditions on content of Res

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Extraction of resveratrol from amur grape residue by cellulase enzymolysis and ultrasonication assisted organic solvent

QIAN Shi-quan，SHI Ya-zhong，WU Ya-hua，LI Shan-ju，SUN Lan-ping，XU Hui
（Department of Bioengineering and Food，Bengbu College，Bengbu 233030，China）

The paper discussed the impact of cellulase enzymolysis and ultrasonication on the extraction of resveratrol from amur grape residue，the research was investigated with the content of resveratrol as the guide and enzymolysis temperature，ultrasonication time，rate of solid to solution，and extraction time were analyzed. The extraction conditions based on single factor experiment were optimized by orthogonal design.The optimum extraction conditions were as follows：the cellulase enzymolysis temperature was 55℃，the ultrasonication time was 5min，the rate of solid to solution was 1∶30 and the extraction time was 4h.Under these optimized conditions，the content of resveratrol was finally determined to be 1.187mg·g-1.The technology combined with cellulase enzymolysis and ultrasonication was inclined to be more effective for improving the content of resveratrol，compared with the individual operation of cellulase enzymolysis and ultrasonication.

resveratrol；cellulase enzymolysis；ultrasonication；organic solvent

TS255.1

B

1002-0306（2012）03-0210-04

2011－04－06

錢(qián)時(shí)權(quán)（1979-），男，碩士，助教，主要從事天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)與食品生物技術(shù)方面的研究。

蚌埠學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目（2010ZR14）；安徽省高等學(xué)校省級(jí)食品科學(xué)與工程特色專(zhuān)業(yè)建設(shè)點(diǎn)（20101091）；安徽省食品科學(xué)與工程教學(xué)團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（20101094）；安徽省青年教師資助項(xiàng)目（2007jq1127）。