李艾黎，孟祥晨,*，徐 漸，邵 紅，馬冬雪

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

嗜酸乳桿菌對β-乳球蛋白過敏誘發(fā)Thl/Th2細(xì)胞平衡的影響

李艾黎1，孟祥晨1,*，徐 漸2，邵 紅1，馬冬雪1

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

目的：觀察嗜酸乳桿菌對牛乳β-乳球蛋白(BLG)致敏小鼠Th1/Th2細(xì)胞平衡及血清抗體水平的影響，以研究其緩解過敏反應(yīng)的作用。方法：用牛乳BLG和弗氏佐劑的混合液腹腔注射誘發(fā)BALB/c小鼠致敏，建立動物過敏模型。將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為空白組、過敏組與不同劑量的嗜酸乳桿菌組。采用ELISA法測定各組小鼠血清總IgE、BLG特異性IgE和總IgG含量。體外分離培養(yǎng)各組小鼠脾淋巴細(xì)胞，采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中Th1型細(xì)胞因子(IL-12、IFN-γ)和Th2型細(xì)胞因子(IL-4)的水平。結(jié)果：中、高劑量嗜酸乳桿菌組小鼠的IFN-γ/IL-4比值(代表Th1/Th2細(xì)胞平衡)顯著高于過敏組(P＜0.05)；而其血清中的總IgE、BLG特異性IgE和總IgG水平顯著低于過敏組(P＜0.05)，與空白組相比無差異性(P＞0.05)。結(jié)論：嗜酸乳桿菌干預(yù)可改善小鼠的BLG過敏癥狀，其作用可能與促進(jìn)Th1占優(yōu)勢的Th1/Th2細(xì)胞平衡，阻斷IgE及IgG分泌相關(guān)。

嗜酸乳桿菌；β-乳球蛋白；牛乳過敏

牛乳β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，BLG)被視為最主要的乳過敏原蛋白質(zhì)之一[1]，能導(dǎo)致Th1/Th2型免疫反應(yīng)失衡，誘發(fā)特異性IgE抗體介導(dǎo)的食物過敏反應(yīng)[2]，嚴(yán)重影響部分人群對優(yōu)質(zhì)乳蛋白的吸收，尤其危及嬰幼兒的身體健康[3]。包括注射抗組胺、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑及免疫佐劑等在內(nèi)的傳統(tǒng)治療方法都具有一定副作用[4]，治療效果難以令人滿意。因此，尋找安全有效的防治牛乳β-乳球蛋白過敏的措施十分必要。

近年來，許多研究學(xué)者[5-7]希望能借助乳酸菌來有效減緩過敏反應(yīng)，并減少藥物的使用量。因?yàn)樵S多乳酸菌在腸道中能通過平衡細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，使免疫系統(tǒng)處于健康和穩(wěn)定的狀態(tài)。但采用乳酸菌來防治牛乳過敏仍屬新興領(lǐng)域，缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究數(shù)據(jù)以及相關(guān)作用機(jī)制的研究來支持該措施的進(jìn)一步應(yīng)用和推廣。

本研究基于乳酸菌與抑制食物過敏的發(fā)生、發(fā)展之間的緊密聯(lián)系，通過建立BLG致敏動物模型，研究給予嗜酸乳桿菌對致敏模型動物過敏反應(yīng)的干預(yù)作用，為乳酸菌防治食物過敏提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

嗜酸乳桿菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

乳清粉 新西蘭進(jìn)口；BCA試劑盒 上海玉博生物科技有限公司；IL-12、IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒 美國R&D公司；總IgE試劑盒 美國Bethyl公司；羊抗鼠IgE酶標(biāo)二抗 英國AbD Serotec公司；羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗 中國中杉金橋公司；RPMI1640培養(yǎng)液 美國Gibco公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程材料公司；淋巴細(xì)胞分離液 北京Salarbio公司；牛乳β-乳球蛋白標(biāo)品、弗氏完全佐劑(FCA) 美國Sigma公司。

1.2 動物

雌性清潔級BALB/c小鼠，6～8周齡，購自哈爾濱腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(23±2)℃，相對濕度50%～75%，標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料喂養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化與菌懸液的制備

嗜酸乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18h后3000×g離心10min收集菌體，用滅菌0.01mol/L、pH 7.4的PBS離心洗滌重懸，調(diào)整所得菌懸液濃度約為2×1010CFU/mL。上述菌懸液經(jīng)100℃、30min熱處理后(檢驗(yàn)證實(shí)無活菌存在，且仍保持正常細(xì)菌形態(tài))，冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 牛乳β-乳球蛋白的制備[8]

以乳清粉為原料，采取高鹽低pH值法分離純化β-乳球蛋白。透析除鹽后凍成干粉備用，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白純度，采用BCA蛋白測定試劑盒(增強(qiáng)型)測定β-乳球蛋白含量。

1.3.3 動物模型的建立[9]

小鼠購進(jìn)后適應(yīng)性喂養(yǎng)4d，隨機(jī)分組(每組8只)，即空白組、致敏組以及嗜酸乳桿菌組。自第1天起，嗜酸乳桿菌組小鼠灌服低、中、高劑量(0.2、1.0、5.0mg)的菌液0.1mL/(d·只)，共28d，空白組同時(shí)以等量生理鹽水灌胃。致敏組和嗜酸乳桿菌組小鼠在第7、21、28天給予腹腔注射0.2mL 0.5mg/mL的過敏原(1mL弗氏佐劑＋1mL 1mg/mL BLG)，空白組小鼠腹腔注射等量生理鹽水。于實(shí)驗(yàn)的第30天，即末次腹腔注射48h后檢測指標(biāo)。

1.3.4 ELISA法檢測細(xì)胞因子[10]

無菌取各組小鼠脾臟，用玻璃針芯在200目篩網(wǎng)上研磨后，加入到RPMI 1640培養(yǎng)液中制成單細(xì)胞懸液。加入淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行離心，分離出淋巴細(xì)胞，再用RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌(4000r/min) 2次。調(diào)細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL。將細(xì)胞與含有100mL/L小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基及BLG (終質(zhì)量濃度1g/L)加入到96孔培養(yǎng)板中，每孔總體積200μL，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。在37℃、50mL/L CO2培養(yǎng)箱飽和濕度條件下培養(yǎng)48h后，離心收集上清。嚴(yán)格按照各ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，在波長450nm處用酶標(biāo)儀測定各孔的光密度值，從相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線查得各樣品的IL-12、IFN-γ、IL-4水平。

1.3.5 ELISA法檢測抗體水平[11]

各組小鼠摘除眼球放血，離心后吸取血清，嚴(yán)格按照各抗體試劑盒說明書檢測小鼠血清中總IgE、BLG特異性IgE和總IgG含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組定量檢測數(shù)據(jù)以x－±s表示，組間比較進(jìn)行單因素方差分析(Oneway ANOVA)，兩兩比較采用LSD法；P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌對致敏小鼠Th1/ Th2細(xì)胞平衡的影響

表1 嗜酸乳桿菌對BLG致敏小鼠Th1/Th2細(xì)胞分泌的影響(±s,n＝3)Table 1 Effect of Lactobacillus acidophilus on Th1/Th2 cell cytokine secretion in BLG sensitized mice (±s,n＝3)

表1 嗜酸乳桿菌對BLG致敏小鼠Th1/Th2細(xì)胞分泌的影響(±s,n＝3)Table 1 Effect of Lactobacillus acidophilus on Th1/Th2 cell cytokine secretion in BLG sensitized mice (±s,n＝3)

注：a.與致敏組相比，差異顯著(P＜0.05)；b.與空白組相比，差異顯著(P＜0.05)。下同。

組別IL-12IFN-γIL-4IFN-γ/ IL-4空白組4.74±0.11623.08±23.3980.34±3.357.75±0.57致敏組4.18±0.10344.87±29.87103.19±4.363.34±0.25低劑量組4.49±0.12543.21±10.51ab77.49±3.81a7.01±0.63a嗜酸乳桿菌中劑量組4.52±0.07608.97±17.34a44.98±5.59ab13.53±0.89ab高劑量組4.61±0.1618.13±12.34a42.61±4.35ab14.50±1.05ab

由于Th1、Th2細(xì)胞的比例同IFN-γ和IL-4的分泌水平密切相關(guān)，故以IFN-γ/IL-4為代表研究乳酸菌對淋巴細(xì)胞Th1/Th2平衡的影響。由表1可知，與致敏組相比，不同劑量嗜酸乳桿菌組小鼠的IL-4質(zhì)量濃度顯著下降(P＜0.05)，而IFN-γ分泌值明顯增高(P＜0.05)。由于嗜酸乳桿菌中、高劑量組比嗜酸乳桿菌低劑量組更明顯地促進(jìn)了IFN-γ的分泌(P＜0.05)，使其IFN-γ/IL-4顯著高于空白組和過敏組(P＜0.05)。

2.2 嗜酸乳桿菌對致敏小鼠抗體分泌的影響

圖1 嗜酸乳桿菌對BLG致敏小鼠血清中總IgE(A)、BLG特異性IgE(B)和總IgG(C)抗體含量的影響Fig.1 Effect of Lactobacillus acidophilus on serum concentrations of total IgE (A), BLG-specific IgE (B) and total IgG (C) of BLG-sensitized mice

由圖1可知，BLG能夠誘導(dǎo)小鼠總IgE、BLG特異性IgE和總IgG水平升高，且顯著高于空白組(P＜0.05)。用不同劑量的嗜酸乳桿菌干預(yù)致敏小鼠后，均能不同程度地降低其血清中抗體的含量，且具有一定的量效關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。特別是中、高劑量嗜酸乳桿菌組更有效地抑制了總IgE、BLG特異性IgE和總IgG的分泌(P＜0.05)，且與空白組相比差異不顯著(P＞0.05)。

3 討 論

研究者多認(rèn)為Th2細(xì)胞占優(yōu)勢的Th1/Th2細(xì)胞失衡是過敏發(fā)病最重要的免疫學(xué)異常[2]：即Th2細(xì)胞作為介導(dǎo)體液免疫的重要細(xì)胞，其數(shù)量增加、功能亢進(jìn)的最終結(jié)果是誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生高水平的IgE應(yīng)答和嗜酸性粒細(xì)胞活化，并引起組胺、白三烯等多種炎性介質(zhì)釋放，導(dǎo)致過敏反應(yīng)發(fā)生。

以往研究表明乳桿菌細(xì)胞壁組分可以作為一種主要的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)[12]，例如未甲基化的CpG、肽聚糖(peptidoglycan，PG)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)等[13]，它們被腸上皮細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)上的Toll樣受體家族 (Toll-like receptor，TLRs)識別后，通過TIR區(qū)域向胞漿內(nèi)傳導(dǎo)信號，激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶[14]，釋放細(xì)胞因子、表達(dá)共刺激分子等[15]，從而激活Th0細(xì)胞向不同的亞型細(xì)胞分化(如Th1、Th2細(xì)胞)，在天然免疫、炎癥反應(yīng)和獲得性免疫中發(fā)揮作用。本研究中熱滅活的嗜酸乳桿菌能誘導(dǎo)致敏小鼠淋巴細(xì)胞分泌IL-12和IFN-γ，降低IL-4水平，使得IFN-γ/IL-4顯著升高，促進(jìn)了Th1型免疫應(yīng)答，即通過逆轉(zhuǎn)Th2細(xì)胞過度亢進(jìn)來阻斷IgE的分泌，這可能是其抑制過敏發(fā)生的機(jī)理之一。該結(jié)果也提示乳酸菌細(xì)胞的完整性，而非菌的存活性，可能是其調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞免疫功能的決定因素。

IgG抗體在過敏反應(yīng)中的作用也日益受到重視，其中IgG4型抗體與食物過敏密切相關(guān)，它可吸附于肥大細(xì)胞表面而參與病理過程[16]。本研究中BLG的激發(fā)亦使過敏組小鼠血清總IgG水平升高，提示嗜酸乳桿菌可能通過下調(diào)總IgG分泌量來緩解過敏反應(yīng)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]CARLO C, FRANCESCO B, BARBARA B, et al. Cow,s milk protein allergy in children: a practical guide[J]. Italian Journal of Pediatrics, 2010, 36(5): 1816-1824.

[2]PASQUALE M, GIUSEPPE M, MARIA L P. Food allergy in gastroenterologic diseases: review of literature[J]. World J Gastroenterol, 2006, 12(48): 7744-7752.

[3]王小卉, 楊毅, 王瑩, 等. 嬰兒腸道菌群的形成及其與食物過敏的關(guān)系[J]. 實(shí)用兒科臨床雜志, 2004, 19(9): 756-758.

[4]ROMAGNANI S. The increased prevalence of allergy and the hygiene hypothesis: missing immune deviation, reduced immune suppression, or both?[J]. Immunology, 2004, 112(3): 352-363.

[5]FLINTERMAN A E, KNOL E F, van IEPEREN-van DIJK A G, et al. Probiotics have a different immunomodulatory potential in vitro versus ex vivo upon oral administration in children with food allergy[J]. Allergy Immunol, 2007, 143(3): 237-244.

[6]AKIKO T, SHINPEI T, SHIGERU F, et al. Lactobacillus acidophilus strain L-92 regulates the production of Th1 cytokine as well as Th2 cytokines[J]. Allergol Int, 2007, 56(3): 293-301.

[7]YUMI I, NORIYUKI I, XIAO J Z. Suppressive effects of Bifidobacterium breve strain M-16V on T-helper Type 2 immune responses in a murine model[J]. Biol Pharm Bull, 2009, 32(4): 760-763.

[8]王子龍, 林召豐, 黃霞, 等. 兩種分離β-乳球蛋白方法的比較[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(12): 153-154.

[9]SEGAWA S, NAKAKITA Y, TAKATA Y, et al. Effect of oral administration of heat-killed Lactobacillus brevis SBC8803 on total and ovalbumin-specific immunoglobulin E production through the improvement of Th1/Th2 balance[J]. International Journal of Food Microbiology, 2008, 121(1): 1-10.

[10]FUJIWARA D, INOUE S, WAKABAYASHI H, et al. The anti-allergic effects of lactic acid bacteria are strain dependent and mediated by effects on both Th1/Th2 cytokine expression and balance[J]. International Archives of Allergy and Immunology, 2004, 135(3): 205-215.

[11]KARINE A P, CHRISTOPHE C, HERVE B, et al. Evaluation of a high IgE-responder mouse model of allergy to bovine β-lactoglobulin BLG: development of sandwich immunoassays for total and allergen-specific IgE, IgG1and IgG2a in BLG-sensitized mice[J]. J Immunol Method, 2000, 235(2): 21-32.

[12]余葉紅, 郭本恒, 吳正鈞, 等. 干酪乳桿菌LC2W細(xì)胞壁組分對RAW264.7巨噬細(xì)胞吞噬活性的影響[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2009, 21(1): 23-29.

[13]NG S C, HART A L, KAMM M A, et al. Mechanisms of action of probiotics: recent advances[J]. Inflamm Bowel Dis, 2009, 15(2): 300-310.

[14]劉偉, 戎蘭, 丁偉群, 等. 實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎大鼠內(nèi)毒素-Toll樣受體4-核因子κB信號通路的變化及益生菌的作用[J]. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志, 2010, 18(1): 900-902.

[15]KANG H, MYUNG E J, AHN K S, et al. Induction of Th1 cytokines by Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (KCTC 3100) under Th2-type conditions and the requirement of NF-κB and p38/JNK[J]. Cytokine, 2009, 46: 283-289.

[16]CATHARINA J, MARIA T L, ROB C A, et al. Elevated levels of IgG and IgG4to Malassezia allergens in atopic eczema patients with IgE reactivity to Malassezia[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2004, 135(2): 93-100.

Effect of Lactobacillus acidophilus on β-Lactoglobulin Induced Mouse Th1/Th2 Cell Imbalance

LI Ai-li1，MENG Xiang-chen1,*，XU Jian2，SHAO Hong1，MA Dong-xue1
(1. Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Objective: To investigate the effects of Lactobacillus acidophilus on the Th1/Th2 cell balance and antibody production in bovine β-lactoglobulin (BLG)-sensitized mice and evaluate its efficacy to relieve consequent allergic reactions. Methods: BALB/c mice were intraperitoneally injected with a mixture of milk BLG and Freund,s adjuvant to create BLG-sensitized mouse models. The mice were randomly divided into blank group, allergic group and different dose of Lactobacillus acidophilus group. The total IgE, BLG-specific IgE and total IgG contents in the serum of mice were measured by ELISA. Splenic lymphocytes were isolated and cultured in vitro to detect the levels of Thl type cytokine (IL-12, IFN-γ) and Th2 type cytokine (IL-4) in the supernatant by ELISA. Results: The IFN-γ/IL-4 ratio, which represents the Th1/Th2 cell balance, increased significantly in both middle- and high-dose Lactobacillus acidophilus groups compared to the allergic group (P＜0.05). At the same time, their serum levels of total BLG-IgE and total IgG decreased significantly (P＜0.05), but showed no significant difference compared to the blank control (P＞0.05). Conclusion: Intragastric administration of Lactobacillus acidophilus may be effective in preventing and alleviating BLG allergic symptoms by restoring the Th1/Th2 cell balance to Th1 dominance and by inhibiting IgE and IgG production.

Lactobacillus acidophilus；β-lactoglobulin；milk allergy

R392.12

A

1002-6630(2012)15-0279-04

2011-06-23

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12511052)

李艾黎(1978—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槿槠肺⑸锛捌渖锕こ?。E-mail：aili-mail@163.com

*通信作者：孟祥晨(1970—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠肺⑸锛捌渖锕こ?。E-mail：xchmeng@163.com